【佳學(xué)基因檢測(cè)】癌癥序列變異解釋與報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)指南：如何高效腫瘤基因檢測(cè)的正確性？

ASCO和CAP聯(lián)合推薦

肺癌基因檢測(cè)單位選擇標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)介

肺癌是中國(guó)先進(jìn)大發(fā)病率癌癥，佳學(xué)基因投入大量人力物力專(zhuān)注于良性、惡性腫瘤的產(chǎn)生原因、阻抑方式、靶向藥物及免疫藥物的選擇和使用方法。提出基因解碼是腫瘤早期預(yù)測(cè)、個(gè)性化治好的信息依據(jù)，并指出基因解碼解密基因序列變異與腫瘤診斷與治療的關(guān)系要優(yōu)先于基于數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的基因檢測(cè)。關(guān)于癌癥序列變異解釋與報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)是將整個(gè)行業(yè)推向正確方向的先進(jìn)步。

1. 引言

基于二代測(cè)序技術(shù)的腫瘤檢測(cè)已越來(lái)越多的應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室中，但目前在不同實(shí)驗(yàn)室間存在檢測(cè)方法、報(bào)告內(nèi)容等方面的差異，這對(duì)遺傳檢測(cè)的解讀以及普及應(yīng)用造成了一定的影響。因此，在不同實(shí)驗(yàn)室間建立統(tǒng)一的分子檢測(cè)結(jié)果的解讀和報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)，及建立行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，顯得尤為迫切。

在2015年春天，在美國(guó)專(zhuān)門(mén)成立了一個(gè)以臨床實(shí)驗(yàn)室為核心的工作組，其組成包含了分子病理協(xié)會(huì)(AMP)、美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)協(xié)會(huì)(ACMG)、美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)與美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)的一線(xiàn)專(zhuān)家，該工作組的主要工作為對(duì)腫瘤及疑似腫瘤相關(guān)的序列變異檢測(cè)建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并在行業(yè)達(dá)成共識(shí)。

該工作組首先對(duì)北美地區(qū)超過(guò)40家的臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了問(wèn)卷調(diào)查，結(jié)果顯示不同實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)組織類(lèi)型、檢測(cè)基因數(shù)量、是否檢測(cè)腫瘤組織全外顯子組或全基因組、以及其他細(xì)節(jié)方面都存在較大差別，此外在不同單位的檢測(cè)報(bào)告的報(bào)告內(nèi)容方面也存在較多差異。該工作組認(rèn)為，為醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供分類(lèi)的遺傳變異報(bào)告對(duì)病人及整個(gè)醫(yī)療行業(yè)都極為重要，包括：提供正確的腫瘤對(duì)靶向治療反應(yīng)性信息；建立先進(jìn)別的醫(yī)療指南；以及與臨床試驗(yàn)合作，對(duì)建立不同實(shí)驗(yàn)室間的通用標(biāo)準(zhǔn)提供支持?；谝陨线@些考量，工作組專(zhuān)家們根據(jù)已有數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)報(bào)道和專(zhuān)業(yè)知識(shí)，給出以下指南建議。

圖1 AMP對(duì)NGS技術(shù)及NGS結(jié)果解讀的調(diào)研

圖注：
A: MAF閾值；B: 變異分類(lèi)數(shù)目；C:報(bào)告中是否包含治療性建議；D: 報(bào)告中是否包含潛在的生殖細(xì)胞突變；
E: 報(bào)告是否包含變異等位頻率Variant allele frequency (VAF)；F: 報(bào)告是否包含基因組坐標(biāo)；
G: 報(bào)告是否包含轉(zhuǎn)錄本ID(Transcript accession)；H: 報(bào)告是否包含不符合質(zhì)控的基因/區(qū)間。

2. 術(shù)語(yǔ)

dbSNP, The Database of Short Genetic Variation;

ExAC, Exome Aggregation Consortium;

IARC, International Agency for Research on Cancer;

NCBI, National Center for Biotechnology Information;

SNV, single-nucleotide variant;

UCSC, University of California, Santa Cruz;

WHO, World Health Organization;

FDA, Food and Drug Administration;

CNV, copy number variation;

COSMIC, Catalog of Somatic Mutations in Cancer;

HGMD, Human Gene Mutation Database;

indel, insertion and deletion;

LOF, loss of function;

MAF, minor allele frequency;

PG, professional guideline;

TCGA, The Cancer Genome Atlas;

VAF, variant allele frequency.
 

3. 數(shù)據(jù)庫(kù)

3.1 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)

3.1.1 大型腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫(kù)

1. The National Cancer Institute’s Genome Data Commons：

• The Cancer Genome Atlas(TCGA)
• Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Therapies(TARGET)
• the Cancer Genome Characterization Initiative

2. Catalog of Somatic Mutations in Cancer

3.1.2 體細(xì)胞序列變異解釋相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)

表1 體細(xì)胞序列變異解釋相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)

表注：
表格為不有效統(tǒng)計(jì)，賊后更新日期2016年6月7日。

3.1.3 臨床實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用公共數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)一般的注意事項(xiàng)

1. 了解數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容及數(shù)據(jù)組織形式；

2. 特別注意數(shù)據(jù)庫(kù)的限制，避免檢測(cè)結(jié)果過(guò)度解讀；

3. 注意基因組與轉(zhuǎn)錄組的組裝版本，應(yīng)與Human Genome Variation Society (HGVS)注釋一致；

4. 根據(jù)已有資源評(píng)估基因組測(cè)序質(zhì)量；

5. 確認(rèn)用于病理診斷的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

3.2 參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)

常見(jiàn)參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)用于人類(lèi)基因組組裝及相關(guān)信息，包括基因組坐標(biāo)，轉(zhuǎn)錄本編號(hào)與版本，外顯子邊界等等。常見(jiàn)的有：

• √RefSeq (National Center for Biotechnology Information Reference Sequence Database,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq, last accessed January 2, 2016),
• √Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html, last accessed January 2, 2016),
• Locus Reference Genomic (https://www.lrg-sequence.org,last accessed February 2, 2016)

3.3 人群數(shù)據(jù)庫(kù)

人群數(shù)據(jù)庫(kù)提供基因多態(tài)性、人群等位基因頻率等信息，用于區(qū)分測(cè)序結(jié)果中的多態(tài)性與突變，常見(jiàn)的有：

• The Database of Short Genetic Variation (the National Center for Biotechnology Information database of genetic variation)
• Exome Variant Server
• √Exome Aggregation Consortium

3.4 腫瘤特異性數(shù)據(jù)庫(kù)

腫瘤特異性數(shù)據(jù)庫(kù)提供匯總之后的不同腫瘤類(lèi)型及亞型間的序列變異發(fā)生率，還包括發(fā)表的文獻(xiàn)、臨床試驗(yàn)、成果數(shù)據(jù)等數(shù)據(jù)，見(jiàn)表1 Cancer-specific variant databases。

3.5 原發(fā)性變異數(shù)據(jù)庫(kù)

原發(fā)性變異數(shù)據(jù)庫(kù)（Constitutional Variant Databases）主要用于區(qū)分生殖系變異與體細(xì)胞變異，常用的有:

• √Human Gene Mutation Database
• √ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)

3.6 內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)（實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生）

臨床實(shí)驗(yàn)室根據(jù)內(nèi)部資源獨(dú)立建立的數(shù)據(jù)庫(kù)，可用于變異注釋?zhuān)改瞎膭?lì)將這些體細(xì)胞變異的注釋數(shù)據(jù)逐步整合到公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源中去促進(jìn)體細(xì)胞變異的解釋。

 

4. 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)算法

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)算法常用于預(yù)測(cè)基因中核苷酸的變化是否會(huì)影響基因的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的功能，總體上看，目前的生物信息學(xué)算法還無(wú)法高效足夠高的特異性（大約60%-80%），因此建議不要將預(yù)測(cè)結(jié)果作為臨床分類(lèi)與臨床決策的證據(jù)。

表2 預(yù)測(cè)序列突變對(duì)基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能影響的算法

表注：
表格為不有效統(tǒng)計(jì)，賊后更新日期2016年6月7日。

5. 變異鑒定與注釋

通常由軟件來(lái)鑒定和注釋變異，比如點(diǎn)突變、插入缺失、結(jié)構(gòu)變異和拷貝數(shù)變異。臨床實(shí)驗(yàn)室需注意軟件工具的局限性。測(cè)序深度、等位基因頻率等信息需加以考慮，在腫瘤異質(zhì)性評(píng)估中等位基因頻率對(duì)體細(xì)胞突變的解讀尤為重要，特別是在缺乏配對(duì)正常樣本的時(shí)候。目前較為通行的注釋文件格式為VCF格式，可從中分析相關(guān)信息。常見(jiàn)軟件有：

表3 突變注釋軟件

表注：
表格為不有效統(tǒng)計(jì)，賊后更新日期2016年6月7日。

表4 突變解析軟件

表注：
表格為不有效統(tǒng)計(jì)，賊后更新日期2016年6月7日。

 

6. 基于證據(jù)的體細(xì)胞變異分類(lèi)的指導(dǎo)意見(jiàn)

基于循證醫(yī)學(xué)的體細(xì)胞變異分類(lèi)的指導(dǎo)意見(jiàn)（Proposed Guideline for Evidence-Based Categorization of Somatic Variants），根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及工作組專(zhuān)家共識(shí)，提議將基因檢測(cè)相關(guān)臨床及實(shí)驗(yàn)證據(jù)分為4級(jí)：

表5 臨床及實(shí)驗(yàn)證據(jù)分類(lèi)

表注：
A級(jí)：可作為FDA批準(zhǔn)治療某種特異性腫瘤的生物標(biāo)志物（biomarker），或被收錄于某些特殊類(lèi)型腫瘤的診斷、治療、預(yù)后評(píng)價(jià)的權(quán)威指南；
B級(jí)：可作為基于強(qiáng)力臨床試驗(yàn)證據(jù)和專(zhuān)家共識(shí)的治療某種特異性腫瘤的生物標(biāo)志物，或用于診斷、預(yù)后評(píng)估；
C級(jí)：可用于指導(dǎo)FDA批準(zhǔn)的標(biāo)注外用藥，或基于多個(gè)小規(guī)模研究的證據(jù)的診斷/預(yù)后評(píng)估；
D級(jí)：結(jié)果不確定的臨床前研究，可作為輔助標(biāo)志物，基于小規(guī)模研究且未達(dá)成共識(shí)。

圖2 基于證據(jù)體細(xì)胞變異分類(lèi)（臨床影響力）

圖注：
I級(jí)：具有強(qiáng)臨床意義的變異（A級(jí)和B級(jí)證據(jù)）；

II級(jí)：具有潛在臨床意義的變異（C級(jí)或D級(jí)證據(jù)）；

III級(jí)：變異的臨床意義不確定；

IV級(jí)：與良性或疑似良性相關(guān)的變異。

7. 檢測(cè)結(jié)果報(bào)告與解讀

• 所有檢測(cè)到的變異都需要根據(jù)臨床影響力4級(jí)分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)標(biāo)識(shí)；
• 所有檢測(cè)到的變異都需要按照HUGO基因命名委員會(huì)規(guī)則注釋與報(bào)告，報(bào)告中也應(yīng)包含其他必要信息；
• 生殖系變異在報(bào)告中可不加以區(qū)分，若報(bào)告生殖系變異需符合當(dāng)?shù)胤膳c政策（患者需簽署知情同意書(shū)等）；
• 報(bào)告檢測(cè)到變異的臨床意義；
• 報(bào)告可隨相關(guān)醫(yī)學(xué)知識(shí)的更新而發(fā)生變化，當(dāng)有特殊需求時(shí)可考慮更新報(bào)告；
• 實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)隨檢測(cè)結(jié)果一同報(bào)告；
• 可將檢測(cè)報(bào)告與電子病歷系統(tǒng)整合。

注：

1. NGS分析無(wú)法區(qū)分體系變異與生殖系變異；

2. 生殖系變異的報(bào)告需要依據(jù)ACMG/AMP指南。

8. 結(jié)論

在癌癥基因組譜中越來(lái)越多地使用NGS技術(shù)，給臨床實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)了新的挑戰(zhàn)。分子專(zhuān)業(yè)人員的關(guān)鍵任務(wù)之一是，基因測(cè)序檢測(cè)到的癌癥相關(guān)序列變體的解釋和報(bào)告的標(biāo)準(zhǔn)化。擬議的“癌癥序列變異解釋與報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)指南”代表了工作組成員的專(zhuān)家一致意見(jiàn)及他們代表的利益相關(guān)者的意見(jiàn)。該建議描述了一個(gè)基于證據(jù)的變量分類(lèi)系統(tǒng)，以及變量注釋?zhuān)诸?lèi)和報(bào)告的過(guò)程。該報(bào)告還列出了常用于NGS數(shù)據(jù)分析的有用的生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫(kù)。這些建議應(yīng)作為臨床實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)業(yè)人員和腫瘤學(xué)家的教育資源，以輔助變體解釋和臨床決策。我們希望本文提供的指南將在癌癥基因組學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并推動(dòng)癌癥患者的基因組檢測(cè)和正確治療實(shí)踐。

9. 免責(zé)聲明

分子病理學(xué)協(xié)會(huì)（AMP）臨床實(shí)踐指南和報(bào)告的開(kāi)發(fā)，旨在為實(shí)踐和特定領(lǐng)域的實(shí)踐提供指導(dǎo)和建議，幫助實(shí)驗(yàn)室和其他衛(wèi)生保健專(zhuān)業(yè)人員。指南或報(bào)告不應(yīng)被視為包括所有正確的方式或方法，或排除其他方式或方法。指南或報(bào)告不能高效任何具體結(jié)果，也不能建立一種護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)。指南或報(bào)告不是要指定對(duì)特定患者的治療。治療決定必須基于健康護(hù)理提供者和每個(gè)患者的個(gè)體情況的獨(dú)立判斷。 AMP對(duì)本指南或報(bào)告不作任何明示或暗示的高效，特別不包括任何對(duì)特定用途或目的適銷(xiāo)性或適用性的高效。 AMP對(duì)與使用本文所含信息相關(guān)的直接，間接，特殊，偶然或繼發(fā)性損失概不負(fù)責(zé)。

10. 參考資料

http://jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(16)30223-9/fulltext#appsec1