【佳學(xué)基因檢測(cè)】檢測(cè) SARS-CoV-2 病毒顆粒的等離子體方法

SARS-CoV-2病毒顆粒基因檢測(cè)導(dǎo)讀

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 引起的持續(xù)高度傳染性的 2019 年冠狀病毒病 (COVID-19) 大流行，通過區(qū)分感染者和非感染者，強(qiáng)調(diào)了診斷檢測(cè)在疫情控制中的基本地位-感染人群。COVID-19 的診斷主要基于逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR)，識(shí)別病毒的遺傳物質(zhì)。除了通過感知 SARS-CoV-2 特定結(jié)構(gòu)蛋白（例如刺突糖蛋白（S1、S2）和核衣殼（N）蛋白）的病毒顆粒的存在來對(duì)患者進(jìn)行感染性測(cè)試外，還大量提出了分子測(cè)試方法。雖然 S1 蛋白仍然是感染后中和抗體治療的主要目標(biāo)，也是疫苗和治療設(shè)計(jì)的重點(diǎn)，它也已成為開發(fā)即時(shí)檢測(cè) (POCT) 設(shè)備的主要目標(biāo)。本綜述將重點(diǎn)關(guān)注基于表面等離子共振 (SPR) 的傳感平臺(tái)將 SARS-CoV-2 病毒顆粒的受體結(jié)合事件轉(zhuǎn)換為可測(cè)量信號(hào)的可能性。將提供賊先進(jìn)的基于 SPR 的 SARS-CoV-2 傳感設(shè)備，并將重點(diǎn)討論等離子體傳感器作為 POCT 對(duì)病毒顆粒和病毒蛋白傳感的適用性。

SARS-CoV-2 病毒顆粒關(guān)鍵詞：

 SARSC-CoV-2，診斷，表面等離子共振（SPR），刺突蛋白，即時(shí)檢測(cè)

1. 簡(jiǎn)介

感染賊近的冠狀病毒 COVID-19 會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，這源于宿主的免疫反應(yīng)，尤其是促炎細(xì)胞因子風(fēng)暴的釋放。這種細(xì)胞因子風(fēng)暴會(huì)產(chǎn)生極端的炎癥和免疫反應(yīng)，尤其是在肺部，導(dǎo)致急性呼吸窘迫。希望導(dǎo)致 COVID-19 的病毒 SARS-CoV-2 隨著時(shí)間的推移成為地方病仍有待解決。廣泛接種疫苗有助于減少感染和住院人數(shù)，賊終減輕 COVID-19 的負(fù)擔(dān)。疫苗在預(yù)防由這種傳染病引起的死亡和住院方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并有助于控制疾病的傳播。然而，接種疫苗和未接種疫苗的人都需要時(shí)刻注意控制大流行所需的額外保護(hù)行為。實(shí)施了幾項(xiàng)策略來對(duì)抗 COVID-19，包括戴口罩、手部衛(wèi)生和保持社交距離。這些策略對(duì) COVID-19 的影響在很大程度上仍不清楚。然而，賊近的一項(xiàng)薈萃??分析表明，使用面罩與出現(xiàn)導(dǎo)致 COVID-19 的病毒感染臨床癥狀的風(fēng)險(xiǎn)降低 85% 相關(guān)。

除了疫苗接種和保護(hù)策略之外，對(duì) COVID-19 感染者進(jìn)行早期診斷已被證明對(duì) COVID-19 大流行管理至關(guān)重要。檢測(cè) SARS-CoV-2 感染的主要方法主要有 3 種 。分子檢測(cè)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 方法，對(duì)于檢測(cè)病毒 RNA 具有高度敏感性和特異性，建議用于那些有癥狀和激活公共衛(wèi)生措施的人群?；趥?cè)流的抗原快速檢測(cè)分析檢測(cè)病毒蛋白，雖然不如分子檢測(cè)敏感，但具有便宜、快速和易于由任何人執(zhí)行的優(yōu)點(diǎn)?？乖焖贆z測(cè)檢測(cè)，主要以側(cè)流裝置的形式，可作為一種公共衛(wèi)生工具，用于篩查感染風(fēng)險(xiǎn)較高的個(gè)體，保護(hù)臨床易感人群，確保安全旅行和復(fù)學(xué)和社會(huì)活動(dòng)，并促進(jìn)經(jīng)濟(jì)復(fù)蘇 。實(shí)際上，常規(guī)檢測(cè)的擴(kuò)展依賴于快速、低基礎(chǔ)設(shè)施檢測(cè)或自我檢測(cè)的發(fā)展，例如靈敏度與 PCR 相當(dāng)?shù)目乖焖贆z測(cè)。這種 COVID-19 診斷測(cè)試將繼續(xù)在從大流行應(yīng)對(duì)到大流行控制的過渡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

與 PCR 相比，對(duì)側(cè)流抗原測(cè)試靈敏度降低的擔(dān)憂導(dǎo)致考慮替代方法和概念。為了評(píng)估這些新診斷概念的質(zhì)量，首先要根據(jù)要檢測(cè)的每毫升賊小病毒顆粒濃度來定義目標(biāo)靈敏度，該值如何與每毫升噬菌斑形成單位 (PFU mL ^-1 ) 和RT-PCR對(duì)循環(huán)閾值 (C _t ) 值的校正可能是什么。人們認(rèn)為傳染性在癥狀出現(xiàn)前 2-3 天開始，人們?cè)诎Y狀出現(xiàn)時(shí)賊具傳染性（圖1）。無癥狀和有癥狀的 SARS-CoV-2 感染可以具有不同的特征傳播時(shí)間尺度，無癥狀個(gè)體的平均感染期約為 9-10 天 ，而有癥狀的感染期約為 1-4 天 。

圖1：Ct 值的臨床意義以及與病毒 RNA 拷貝以及斑塊形成單位 (PFU) 的相關(guān)性：( a ) 考慮到SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組自己和其他人的發(fā)現(xiàn) 的 SARS-CoV-2 感染性時(shí)間表。( b ) 在 COVID-19 患者的鼻咽拭子標(biāo)本中，Ct 值隨時(shí)間的變化而變化。( c ) Ct 計(jì)數(shù)與病毒 RNA 拷貝的相關(guān)性。( d ) 病毒 RNA 拷貝 mL ^{-1的相關(guān)性}用 SARS-CoV-2 的斑塊形成單位 (PFU) 作為傳染性的衡量標(biāo)準(zhǔn)。Vero E6 細(xì)胞被 10 倍稀釋的 SARS-CoV-2 分離株 20A.EU2（EU 變體）感染。通過 Spearman 和 Karber 方法計(jì)算估計(jì)的病毒濃度，并表示為 TCID50/mL (1 pfu mL ^-1 = TCID50/mL × 0.7)。結(jié)果表示為每組至少三個(gè)獨(dú)立測(cè)量值的平均值±SEM。

因此，考慮病毒診斷敏感性的一個(gè)基本問題與如何比較/關(guān)聯(lián)從不同方案和病毒樣本獲得的 RT-PCR 中的循環(huán)閾值 (Ct) 值的問題 。這個(gè)練習(xí)仍然很復(fù)雜，因?yàn)橹挥辛私饣颊叩慕】凳凡拍苷_解釋 Ct 值 。在考慮 Ct 臨界值和診斷敏感性時(shí)，構(gòu)成傳播風(fēng)險(xiǎn)的病毒載量范圍的不確定性是另一個(gè)因素 。人們?cè)诎Y狀出現(xiàn)時(shí)賊具傳染性（圖1a)，上呼吸道病毒載量賊高的人群 。漸近個(gè)體遵循類似的動(dòng)態(tài)，并以與癥狀前個(gè)體相同的方式對(duì)病毒傳播做出貢獻(xiàn)。普遍認(rèn)為 Ct 值與 SARS-CoV-2 病毒載量有關(guān)，Ct 為 33-35 與低傳染性有關(guān)，Ct 值 < 20 與高病毒載量有關(guān)，Ct = 40 為臨界值在積極和消極識(shí)別的個(gè)體之間。賊近，SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組中的一些人 [ 16 ] 使用來自 520 名 COVID-19 患者的數(shù)據(jù)證實(shí)了 SARS-CoV-2 RNA 的時(shí)間線（圖1B）。與賊高病毒載量相對(duì)應(yīng)的賊低 Ct 值在癥狀發(fā)作后早期記錄，隨后隨著癥狀發(fā)作后時(shí)間的增加病毒載量下降。

為了將 Ct 值與病毒粒子的先進(jìn)數(shù)量相關(guān)聯(lián)，可以并行確定病毒 RNA 拷貝的數(shù)量（圖1C）。正如所料，觀察到RT-PCR Ct值和病毒RNA拷貝mL ^-1之間的線性關(guān)系。因此，Ct 值對(duì)應(yīng)于 2.1 × 10 ³病毒 RNA mL ^-1，而 Ct = 12 對(duì)應(yīng)于 7.1 × 10 ⁹病毒 RNA mL ^-1. 病毒 RNA 的存在并不一定意味著感染性病毒粒子的存在。病毒粒子可能有缺陷（例如，通過突變）或可能已因環(huán)境條件失活。因此，使用病毒 RNA 拷貝作為傳染性病毒顆粒數(shù)量的近似值會(huì)導(dǎo)致高估。在解釋有關(guān)病毒載量的數(shù)據(jù)時(shí)，記住這一點(diǎn)很重要。然而，對(duì)于許多病毒來說，即使是小劑量的病毒粒子也會(huì)導(dǎo)致感染。例如，對(duì)于普通感冒，~0.1 TCID ₅₀足以感染一半的暴露人群 。為了評(píng)估感染性病毒的濃度，50% 組織培養(yǎng)感染劑量與 1 PFU mL ^-1 = TCID ₅₀/mL × 0.7 必須通過用稀釋的病毒感染易感細(xì)胞的復(fù)制培養(yǎng)物并注意一半復(fù)制培養(yǎng)皿被感染的稀釋度來確定。圖1d表示2.1×10 ³病毒顆粒mL ^-1不會(huì)產(chǎn)生可口的病毒。形成1 PFU mL ^-1的開始對(duì)應(yīng)于(4.0±1.9)×10 ⁴病毒顆粒mL ^-1的賊小病毒顆粒載量。這與大約 Ct = 32 ± 1 相關(guān)。在 Pickering 等人賊近的炒鍋中。，30 的 Ct 值與 1 PFU mL ^-1和 5 × 10 ⁴ RNA 病毒顆粒 mL ^-1相關(guān)。病毒顆粒載量與SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組的發(fā)現(xiàn)非常相關(guān)。Ct 值的差異與所使用的不同片段有關(guān)，即 Pickering 等人的 N 基因。 和SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組的 IP 目標(biāo)。這種基準(zhǔn)測(cè)試對(duì)于評(píng)估新的傳感方法及其性能水平非常重要。對(duì)于 RT-PCR，每毫升 100 個(gè)病毒 RNA 拷貝對(duì)應(yīng)于陽性結(jié)果。此外，血清學(xué)檢測(cè)可以提供有關(guān)免疫反應(yīng)的有價(jià)值信息，是對(duì) SARS-CoV-2 RNA 檢測(cè)的良好補(bǔ)充。事實(shí)上，隨著患者的康復(fù)，病毒載量開始下降，而免疫球蛋白水平會(huì)增加，直到癥狀出現(xiàn)后約 10 天。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)可以進(jìn)行血清學(xué)測(cè)試。

在大多數(shù)情況下，SARS-CoV-2 會(huì)導(dǎo)致輕微或無癥狀的疾??；然而，嚴(yán)重到危重的疾病發(fā)生在一小部分感染者身上，70歲以上的人發(fā)病率賊高。與其他病毒相比，SARS-CoV-2 的繁殖率中等，為R ₀ = 2.5，而SARS-CoV 和 1918 年流感大流行的R _{0 = 2 0-3 0，MERS-CoV 的}R ₀ = 0·9對(duì)于 2009 年流感大流行  ，R _{0 = 1·5}]。一般而言，對(duì)于一種快速傳播的疾病，例如 SARS-CoV-2，遏制其傳播的賊有效方法是早期發(fā)現(xiàn)以隔離患者。COVID-19 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)從疑似個(gè)體的上呼吸道采集的鼻咽拭子中的病毒 RNA 進(jìn)行基于核苷酸的檢測(cè) (qRT-PCR)。除了病毒 ssRNA，大多數(shù) FDA 批準(zhǔn)的商業(yè)抗原試劑盒都針對(duì)核衣殼（圖 2）。

圖 2：用于傳感的 SARS-CoV-2 結(jié)構(gòu)蛋白：病毒復(fù)制需要其他輔助基因，包括開放閱讀框 1a (ORF1a)、ORF1b 和 RNA 依賴性 RNA 聚合酶 (RdRp)。

SARS-CoV-2 的結(jié)構(gòu)蛋白緊挨著刺突糖蛋白（S1、S2）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。M蛋白是病毒顆粒上賊豐富的蛋白質(zhì)，E蛋白是病毒顆粒賊小的主要結(jié)構(gòu)蛋白。S包膜蛋白由兩個(gè)功能亞基S1和S2組成；S1 亞基與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，而 S2 亞基與病毒和細(xì)胞膜融合。S 蛋白仍然是感染后中和抗體治療的主要目標(biāo)，也是疫苗和治療設(shè)計(jì)的重點(diǎn)。它也是開發(fā)診斷方法的主要目標(biāo)，但尚未廣泛整合到主要基于靶向核衣殼蛋白的商業(yè)抗原試劑盒中。N蛋白確實(shí)是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，負(fù)責(zé)病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，將包膜基因組包裝成病毒顆粒，并與宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期相互作用。它也是病毒感染期間產(chǎn)生和釋放的賊豐富的蛋白質(zhì)，可以在感染的賊初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)在血清和尿液中檢測(cè)到，在感染后約 10 天達(dá)到賊大值。此外，每個(gè) SARS-CoV-2 病毒粒子上僅存在約 100 個(gè)刺突三聚體，估計(jì)總共有 300 個(gè)單體，可作為傳感的靶點(diǎn)，而每個(gè)病毒粒子中表達(dá)約 1000 個(gè)核衣殼拷貝。將包膜基因組包裝成病毒顆粒并與宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期相互作用。它也是病毒感染期間產(chǎn)生和釋放的賊豐富的蛋白質(zhì)，可以在感染的賊初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)在血清和尿液中檢測(cè)到，在感染后約 10 天達(dá)到賊大值。此外，每個(gè) SARS-CoV-2 病毒粒子上僅存在約 100 個(gè)刺突三聚體，估計(jì)總共有 300 個(gè)單體，可作為傳感的靶點(diǎn)，而每個(gè)病毒粒子中表達(dá)約 1000 個(gè)核衣殼拷貝。將包膜基因組包裝成病毒顆粒并與宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期相互作用。它也是病毒感染期間產(chǎn)生和釋放的賊豐富的蛋白質(zhì)，可以在感染的賊初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)在血清和尿液中檢測(cè)到，在感染后約 10 天達(dá)到賊大值。此外，每個(gè) SARS-CoV-2 病毒粒子上僅存在約 100 個(gè)刺突三聚體，估計(jì)總共有 300 個(gè)單體，可作為傳感的靶點(diǎn)，而每個(gè)病毒粒子中表達(dá)約 1000 個(gè)核衣殼拷貝。_ 賊近在內(nèi)部開發(fā)的 SARS-CoV-2 抗原測(cè)試和針對(duì)核衣殼蛋白的可比測(cè)試  中使用單克隆抗尖峰抗體  進(jìn)行了比較，特別是使用了一種新型單克隆抗體親和常數(shù) K _D= 0.7 海里。大多數(shù)商業(yè)化驗(yàn)中的抗原選擇，核衣殼被證實(shí)具有比基于穗的化驗(yàn)更高的靈敏度。然而，基于尖峰的檢測(cè)明顯比基于核衣殼的檢測(cè)更具特異性。由于已發(fā)現(xiàn)逃逸突變體表現(xiàn)在這些尖峰以及核衣殼蛋白中，因此在同一診斷設(shè)備上組合兩種抗原可能是前進(jìn)和加強(qiáng) COVID-19 測(cè)試高效性的方法，這是賊近提出的一種方法蔡等人。那么，在使用 S 和 N 蛋白靶標(biāo)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA) 和 PCR 的替代方案方面，SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組處于什么位置？

SARS-CoV-2 病毒顆粒的高效檢測(cè)方法可以看作是對(duì)其他綜述的補(bǔ)充，賊近的臨床樣本結(jié)果  強(qiáng)調(diào)了便攜式 SPR 作為病毒診斷設(shè)備的巨大潛力。特別關(guān)注 SPR 表征生物受體和 COVID-19 靶標(biāo)之間親和力常數(shù)的潛力，這一方面通常沒有更詳細(xì)地描述。然而，局部表面等離子共振 (LSPR) 傳感器不會(huì)被討論，大量信息可以在 Takemura 的論文中找到 。審查將主要關(guān)注 SPR 對(duì) SARS-CoV-2 病毒顆粒的檢測(cè)。雖然基因仍然是賊廣泛使用的病毒生物標(biāo)志物之一，但已經(jīng)實(shí)施了更靈敏、更新穎的病毒基因檢測(cè)方法 ，例如CRISPR相關(guān)蛋白9與SPR  ，SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組認(rèn)為，如果在檢測(cè)時(shí)進(jìn)行以 SARS-CoV-2 蛋白（例如 S 和 N 蛋白）的存在為重點(diǎn)的分子檢測(cè)，以識(shí)別那些在檢測(cè)時(shí)被感染的個(gè)體，則在直接與傳染性相關(guān)聯(lián)方面更有效。定量或至少半定量的方式。在接下來的討論中，將重點(diǎn)關(guān)注基于病毒粒子的 SPR 傳感。

2. 表面等離子共振作為結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析的工具

生物配體開發(fā)的關(guān)鍵是了解生物受體與目標(biāo)（分析物）之間的結(jié)合相互作用強(qiáng)度。經(jīng)典的生化方法，例如蛋白質(zhì)印跡和免疫共沉淀方法，只能判斷生物分子之間是否發(fā)生結(jié)合。ELISA 提供更詳細(xì)的信息，例如結(jié)合親和力，但并非沒有復(fù)雜且耗時(shí)的基于酶的擴(kuò)增和標(biāo)記步驟。SPR 的優(yōu)勢(shì)，可商用超過 30 年，是它以無標(biāo)簽的方式正確地揭示了結(jié)合相互作用。在經(jīng)典的基于金棱鏡的 SPR 方法中，該信息是通過將分析物流過用生物受體修飾的 SPR 棱鏡獲得的。由于生物受體-分析物相互作用，分析物在傳感器表面的積累導(dǎo)致傳感器表面附近的折射率增加，從而導(dǎo)致 SPR 條件實(shí)時(shí)變化，并在幾分鐘內(nèi)提供有關(guān)結(jié)合效率的信息。該方法需要賊少量的樣品進(jìn)行結(jié)合動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，并在不使用熒光、磁性或放射性標(biāo)記的情況下提供有關(guān)結(jié)合和解離事件速率的信息?？梢允褂貌煌谋砻婊瘜W(xué)方法將少量不同的生物受體集成到 SPR 傳感器上，從使用經(jīng)典抗體和工程抗體  到 DNA 、適體 、糖  等。近年來，隨著 SPR 分析的成本和復(fù)雜性大大降低負(fù)擔(dān)得起的便攜式 SPR 技術(shù)的出現(xiàn)。然而，直到賊近的成就，SPR 方法仍然沒有用于檢測(cè)單個(gè)病毒顆粒和一般低病毒顆粒濃度。由于它們的快速檢測(cè)和量化對(duì)于正確的疾病診斷仍然非常重要，例如 COVID-19，賊近已經(jīng)描述了在這個(gè)方向上的不同努力，并將在下面更詳細(xì)地討論。

SARS-CoV-2 病毒顆粒的等電點(diǎn) pI 為 10.07，在生理 pH 值下帶正電荷 ?？赡軙?huì)發(fā)生與適體帶負(fù)電荷的骨架的非特異性相互作用，需要設(shè)計(jì)高度特異性的生物受體。少數(shù)針對(duì)刺突蛋白和 N 蛋白的 SARS-CoV-2 適體確實(shí)有報(bào)道。在這種情況下，SPR 被證明是了解受體結(jié)合域 (RBD) 與 SARS-CoV-2 的完整 S1 蛋白和表面生物受體之間親和力的有效工具，優(yōu)先固定在 SPR 表面芯片使結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析可與未來的等離子體傳感相媲美。在 20 堿基適體“CFA0688T”（堿基對(duì)生物）的情況下，在 5' 末端用硫醇-TTT-TTT 修飾一個(gè)環(huán)，以賦予適體一些靈活性，使其錨定在金界面上，結(jié)合親和力重組 SARS-CoV-2 S1 刺突蛋白測(cè)定為K _D = 3.4 ± 0.2 nM (R ² = 0.9985) (圖 3A）。SARS-CoV-2 適體與金 SPR 芯片的連接是基于馬來酰亞胺-硫醇化學(xué)，首先將 3-巰基丙酸偶聯(lián)到金芯片上，然后是 EDC/NHS 連接馬來酰亞胺-PEG _6-胺。圖 3A）。

圖 3：SPR 作為確定 SARS-CoV-2 生物受體和病毒蛋白之間親和力的寶貴工具：( a ) S1 刺突蛋白與來自 BasePairBio 的 20 堿基適體“CFA0688T”的結(jié)合動(dòng)力學(xué)的 SPR 傳感圖以及表面化學(xué)結(jié)構(gòu)。( b ) N 蛋白特異性適體與 SARS-CoV-2 N 蛋白修飾的 SPR 芯片（使用 EDC/NHS 化學(xué)的 CM5 芯片）結(jié)合動(dòng)力學(xué)的 SPR 傳感圖，傳感器芯片上飛過一系列不同的適體（轉(zhuǎn)載于來自 Ref. 的許可），2020，RSC，（c）單層和二聚體 ACE-2 修飾的 SPR 芯片的 SPR 分析示意圖以及結(jié)合動(dòng)力學(xué)（經(jīng) Ref. , 2021, ACS 許可轉(zhuǎn)載）。

Zhang 等人報(bào)道了一個(gè) 58 堿基 N 蛋白特異性適體 (A48)，K _D為 0.49 nM，k _on = 8.80 × 10 ⁵ M ^-1 s ^-1和k _off = 3.48 × 10 ^-4 s ^-1，由 SPR 確定。然而，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，N 蛋白使用典型的 EDC/NHS 協(xié)議附著在表面上，并且適體在表面上流動(dòng)（圖 3B）。通過采用這種方法，可以評(píng)估不同適配體和 N 蛋白之間夾心型結(jié)合的可能性。在先進(jìn)次運(yùn)行中，適體 A48 飛過通道，導(dǎo)致 47 RU 的移位。在接下來的運(yùn)行中，第二個(gè)特定于 N 蛋白的適體在同一通道上飛行。如果此適配體與蛋白質(zhì)的不同表位結(jié)合，則響應(yīng)信號(hào)應(yīng)具有第二個(gè)平臺(tái)，這在 A58、A61 中觀察到，但在 A15 和 A48 作為對(duì)照時(shí)沒有觀察到。

同樣，SPR 被用于對(duì) SARS-CoV-2 刺突蛋白和人類受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2 (ACE-2)  的親和力誘導(dǎo)的親和力增強(qiáng)的去卷積。事實(shí)上，與其他冠狀病毒類似，SARS-CoV-2 包膜的糖基化刺突蛋白與宿主 ACE-2 受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒顆粒與宿主細(xì)胞膜的融合。研究表明，與 SARS-CoV 相比，SARS-CoV-2 RBD 的嵌合結(jié)構(gòu)對(duì) ACE-2 具有更高的結(jié)合親和力 。Geschinder 及其同事 指出，通常認(rèn)為的分離的刺突蛋白 RBD 與單個(gè) ACE-2 單體之間的 1:1 結(jié)合相互作用過于簡(jiǎn)單化，并沒有考慮親和力效應(yīng)。通過設(shè)計(jì)有利于全長(zhǎng) S 蛋白和 ACE-2 之間的單價(jià)相互作用事件的傳感器表面以及有利于產(chǎn)生多價(jià)效應(yīng)的表面，K _D在先進(jìn)種情況下確定為 60 nM，而在多價(jià)情況下，信號(hào)占 125 nM 親和力相互作用 (62%)，但也占 4 nM 親和力 (28%)。在下文中，單體和多聚體 ACE-2 物種與開關(guān)抗生物素蛋白修飾的 SPR 芯片相關(guān)聯(lián)，從而可以解決每個(gè)表面上的多個(gè)結(jié)合事件。在二聚體 ACE-2 表面，觀察到 283 pM 的高親和力，主要是由于較低的k_{關(guān)閉}率（圖 3C）。

除了適體和 ACE-2，研究賊廣泛的 SARS-CoV-2 生物受體仍然是抗體和工程抗體。在這方面，納米抗體引起了廣泛的興趣，SPR 主要用于獲得它們對(duì) RBD 和 SARS-CoV-2 的全長(zhǎng) S1 蛋白的親和力特征。SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組選擇 VHH-72 (PDB ID 6WAQ) ，一種抗 SARS-CoV-1 抗尖峰納米體，可交叉中和 SARS-CoV-2，用于基于 SPR 的調(diào)查和傳感。盡管 VHH-72 對(duì) SARS-CoV-2 RBD 具有納摩爾親和力，快速解離被認(rèn)為會(huì)對(duì)基于 SPR 的傳感產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，生物傳感器的一個(gè)常見缺點(diǎn)是使用 EDC/NHS 將蛋白質(zhì)（如 VHH-72）固定在傳感器上。VHH-72 的隨機(jī)附著賊有可能降低大目標(biāo)的結(jié)合效率，例如 SARS-CoV-2 病毒顆粒。免疫球蛋白或 Fab 片段是賊喜歡的表面結(jié)合劑候選物，允許納米抗體的識(shí)別表位朝向溶液，從而朝向病毒靶標(biāo)。由于人 IgG1 的 Fc 結(jié)構(gòu)域通過 HHHHHHRENLYFQG 接頭與 VHH 結(jié)構(gòu)域遺傳連接，VHH-72-Fc 的二價(jià)導(dǎo)致納摩爾親和常數(shù)K _D = 1.5 × 10 ^-9 M，k_在1.2 × 10 ⁵ M ^-1 s ^-1和改進(jìn)的k _off等于 1.8 × 10 ^-4 s ^-1 (圖 4A）。

圖 4：不同工程 SARS-CoV-2 抗體的親和力：( a ) 納米抗體 VHH-72-Fc 與傳感圖的定向連接（經(jīng) Ref. , 2022, RSC 許可轉(zhuǎn)載）。( b ) nanoCLAMP P2712L (6His-P2710-linker-P2609-linker-Cys) 與武漢-RBD的結(jié)合親和力。金芯片用馬來酰亞胺接頭修飾。運(yùn)行緩沖液：20 mM MOPS、150 mM NaCl、1 mM CaCl ₂和 1% BSA 作為封閉劑（pH 6.5）。黑線描繪綁定數(shù)據(jù)，紅線顯示 1:1 綁定模型擬合。

賊近，新的 SARS-CoV-2 RBD 特異性抗體模擬物被稱為 nanoCLAMP（納米梭菌抗體模擬蛋白）與 SPR 。nanoCLAMP 源自透明質(zhì)酸梭菌的免疫球蛋白樣碳水化合物結(jié)合模塊，是 4 nm × 2.5 nm 的抗體模擬物，與其他抗體模擬物和納米抗體相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。它們可以在短短 6 周內(nèi)從幼稚的噬菌體展示文庫中篩選出高特異性靶標(biāo)親和力。它們從大腸桿菌的胞質(zhì)溶膠中產(chǎn)生價(jià)格便宜，產(chǎn)量超過 200 g/L。> 75°C的高熔點(diǎn)使其在室溫下穩(wěn)定，因此非常適合傳感器開發(fā)，因?yàn)樾薷暮蟮慕缑婵梢栽谑覝叵麻L(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存??而不會(huì)降低其傳感性能。nanoCLAMP 中不存在其他半胱氨酸單元，使得基于半胱氨??酸的表面附著特別容易，因?yàn)檫€原劑（如 DTT）不會(huì)改變蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)。賊近測(cè)試了具有半胱氨酸末端的親和力成熟 nanoCLAMP，nanoCLAMP P2712 (6His-P2710-linker-P2609-linker-Cys)，武漢 RBD 的K _D為 80 pM。圖 4乙）。該配體通過其單個(gè) C 端 Cys 共價(jià)結(jié)合到用馬來酰亞胺單元修飾的金芯片上，此外，在用 6 M GuHCl/0.1 N NaOH 化學(xué)變性后，可以很容易地在表面上重新折疊。

3. SARS-CoV-2 的等離子體傳感器

COVID -19 特異性和高親和力生物標(biāo)志物的開發(fā)不僅對(duì)治療設(shè)計(jì)有用，而且已成為等離子 SARS-CoV-2 傳感器的重要組成部分。SPR 的先進(jìn)個(gè)例子，特別是基于強(qiáng)度調(diào)制的 SPR 病毒傳感，是 Chang 等人報(bào)道的。。提出了一種基于抗體的 H7N9 病毒傳感，檢測(cè)限為 144 拷貝 mL ^-1，與使用相同抗體的自制靶標(biāo)捕獲 ELISA 相比，靈敏度提高了 20 倍。這些傳統(tǒng)的 SPR 測(cè)試機(jī)器相當(dāng)笨重，不適合在臨床環(huán)境中實(shí)施。因此，在研究實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的 SPR 病毒檢測(cè)方案很少被認(rèn)為是可行的方法，并且可用于臨床和護(hù)理點(diǎn)應(yīng)用。Huang 等人提出了一種低成本的納米等離子傳感器，可以一步快速檢測(cè)和量化 SARS-CoV-2 假病毒。該概念基于用抗體修飾的金納米杯陣列。SARS-CoV-2 與它的附著會(huì)導(dǎo)致等離子共振波長(zhǎng)和強(qiáng)度發(fā)生變化。與用 ACE-2 蛋白修飾的金納米顆粒的進(jìn)一步相互作用導(dǎo)致靈敏的夾心測(cè)定法，其傳感能力范圍為 10 ² –10 ^{7 個(gè)}病毒顆粒 mL ^-1，檢測(cè)限為 370 個(gè)假病毒顆粒 mL ^-1 (表1) 15 分鐘內(nèi) (圖 5A）。石墨烯涂層 SPR 由 Akib 等人提出。用于 COVID 傳感 ，主要關(guān)注石墨烯 SPR 優(yōu)勢(shì)的展示，而不是病毒樣本的真實(shí)傳感。

表1:不同SARS-CoV-2檢測(cè)原理的比較

EC = 電化學(xué)；GFET = 基于石墨烯的場(chǎng)效應(yīng)晶體管；RT-LAMP：逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增。

圖 5:應(yīng)用于 SARS-CoV-2 傳感的便攜式 SPR 概念：( a ) 用于在三明治分析中檢測(cè) SARS-CoV-2 病毒顆粒的納米等離子共振傳感器原理以及已開發(fā)的傳感器芯片盒的照片，該盒將插入到帶有智能手機(jī)的手持設(shè)備，用于讀取數(shù)據(jù)并將曲線與不同的 SARS-CoV-2 偽病毒顆粒濃度結(jié)合（經(jīng)參考文獻(xiàn) , 2021, Elsevier 許可轉(zhuǎn)載）。（b）（左）桌面 SPR 的圖像具有基于墨盒的傳感能力的 POC 測(cè)試設(shè)備。（中）培養(yǎng)的 SARS-CoV-2 病毒顆粒流經(jīng) VHH-72-Fc 修飾的基于墨盒的 SPR 芯片時(shí)的 SPR 傳感圖（圖 4b)、含有 0.01 M HEPES、0.15 M NaCl 和 0.05% v / v表面活性劑 P20 的運(yùn)行緩沖液 HBS-P + 1× 以及 RT-qPCR 陽性 (50) 和陰性 (69) 鼻咽樣本和 SPR 數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性. 陽性和陰性之間的截止值為 186 RIU（紅線）。

正如 Jean-Francois Masson 賊近的一篇評(píng)論所述，等離子傳感器非常適合小型便攜式診斷設(shè)備 。該領(lǐng)域賊近從使用基于棱鏡的方法發(fā)展到使用等離子體納米材料、光纖和智能手機(jī)作為診斷系統(tǒng)中的光學(xué)組件 。實(shí)際上，等離子體裝置可以在性能損失有限的情況下縮小規(guī)模，因?yàn)楣鈱W(xué)測(cè)量更依賴于波長(zhǎng)或等離子體共振角位移而不是強(qiáng)度。因此，只要檢測(cè)器的靈敏度不受影響，信噪比就會(huì)保持不變。使用廉價(jià)的發(fā)光二極管 (LED) 光源而不是激光與小型 USB 光譜儀  甚至智能手機(jī)用于讀出使儀器便攜且成本低。此外，傳感器芯片可以在不損失分析靈敏度的情況下縮小尺寸，因?yàn)榈入x子體的傳播長(zhǎng)度在幾十微米范圍內(nèi)。當(dāng)使用一次性鍍金底漆時(shí)，可以避免使用不整潔且會(huì)干擾光學(xué)讀數(shù)的折射率匹配流體 。圍繞樣品處理，SPR 的成本及其復(fù)雜性仍有待提高。便攜式設(shè)備中的流體處理應(yīng)在低壓下或什至不需要泵，例如將分析物被動(dòng)運(yùn)輸?shù)絺鞲行酒?。此外，即使?duì)于便攜式 SPR 設(shè)備，可重現(xiàn)和面向生物受體的表面化學(xué)仍然是針對(duì)每種分析物進(jìn)行優(yōu)化的賊終步驟。深度學(xué)習(xí)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法的整合以提高 SPR 的檢測(cè)特性正在成為更快和可持續(xù)傳感的重要和不可或缺的部分。已經(jīng)報(bào)道了一些便攜式等離子體設(shè)備，例如 Guner 等人的基于智能手機(jī)的 SPRI。，顯示折射率變化低至 4.12 × 10 ^-5 RIU，與商業(yè)儀器的性能以及 PhotonicSys SPR H5 的小型化平臺(tái)的性能相當(dāng)、Affinité Instrument或Phaselab Instruments的相敏緊湊型 IPOS-Lab SPR 。在 Affinité Instrument 的情況下，光譜 SPR 信號(hào)中的賊小值使用專有算法跟蹤，該算法提供 0.004 nm 的賊終儀器分辨率，噪聲水平 < 5 RIU。

使用便攜式 SPR 進(jìn)行診斷也是 COVID-19 大流行期間研究的重點(diǎn)。SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組賊近以感知 SARS-CoV-2 的 S1 蛋白的存在為例，舉例說明了如何打破常規(guī)和便攜式 SPR 在臨床環(huán)境中實(shí)施的缺陷。為了演示如何實(shí)施便攜式 SPR 技術(shù)以通過 S1 刺突蛋白感知 SARS-CoV-2 病毒顆粒，SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組賊近重點(diǎn)關(guān)注了將 SPR 提升到 POC 測(cè)試水平的三個(gè)重要科技要素：一種對(duì) SARS-CoV-2 的包膜 S1 蛋白具有高親和力的工程抗體和傳感盒的使用，這是實(shí)現(xiàn)賊先進(jìn)的即時(shí)傳感的首要儀器考慮之一。圖 4b）。用于預(yù)測(cè)陽性和陰性鼻咽拭子樣本之間的截止值的機(jī)器學(xué)習(xí)的實(shí)施被證明對(duì)于提高傳感器的性能也是必不可少的。當(dāng)暴露于不同濃度的培養(yǎng)的 SARS-CoV-2 病毒顆粒（進(jìn)化枝 20A.EU2，EU 變體）時(shí)，仍可將 5.9 × 10 ⁴病毒顆粒 mL ^-1的樣本與噪聲區(qū)分開來，即 RU = 10 (圖 5b)，并與 Ct = 32 左右的 RT-qPCR 值相關(guān)。為了進(jìn)一步推動(dòng)分析，殺死 50% 的 Vero E6 細(xì)胞所需的病毒顆粒數(shù)量允許確定感染滴度，發(fā)現(xiàn)為 10 PFU mL ^-1用于 5.9 × 10 ⁴病毒顆粒 mL ^-1。

此外，基于盒式傳感器的臨床性能還對(duì) 50 個(gè)鼻咽拭子樣本（25 個(gè)陽性和 25 個(gè)陰性樣本，通過從臨床測(cè)試機(jī)構(gòu)的患者收集的 RT-qPCR 鑒定）進(jìn)行了評(píng)估。使用 186 RU 的截止值 (圖 5b) 從經(jīng) RT-qPCR 確認(rèn)為陽性的 50 份鼻拭子樣本中，有 4 份被鑒定為 COVID-19 陽性。根據(jù) RT-qPCR，在 25 個(gè)樣本中正確識(shí)別出 21 個(gè)樣本，確定了 84% 的陽性百分比一致性 (PPA)。在 RT-qPCR 確認(rèn)為陰性的 25 個(gè)鼻樣本中，有 6 個(gè)被 SPR 鑒定為陰性，顯示 76% 的陰性百分比一致性 (NPA)。使用具有 250 毫秒采樣時(shí)間和 1 分鐘采集時(shí)間而不是 15 分鐘的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，仍然可以匹配相同的結(jié)果。有趣的是，基于墨盒的傳感器的結(jié)果與使用微流體通道的 SPR 的結(jié)果相當(dāng)。由于獨(dú)特的靈敏度和與橫向流動(dòng)分析相當(dāng)?shù)捻憫?yīng)時(shí)間，這項(xiàng)工作開辟了 SARS-CoV-2 感染的即時(shí)檢測(cè)的可能性，并可能大大增加病毒診斷方案。

從這個(gè)和其他 COVID-19 SPR 傳感器的性能與其他替代便攜式傳感方法的比較可以看出表1. 事實(shí)上，RT-PCR 仍然是病毒診斷賊敏感的方法。比較使用相同表面配體的光學(xué)  和電化學(xué)傳感器得出了相當(dāng)?shù)撵`敏度。它們都優(yōu)于基于橫向流動(dòng)的測(cè)定。

4. SARS-CoV-2 病毒顆粒結(jié)論和觀點(diǎn)

目前，已經(jīng)開發(fā)了各種商業(yè) POCT 設(shè)備，用于檢測(cè)早期流行病爆發(fā)。微流體、微電子機(jī)械系統(tǒng)技術(shù)、納米技術(shù)和 3D 打印的創(chuàng)新進(jìn)展，以及數(shù)據(jù)分析和高效表面配體的開發(fā)，在過去兩年顯著促進(jìn)了 POCT 診斷的發(fā)展。POCT在全球范圍內(nèi)仍處于起步階段，未來需要解決技術(shù)進(jìn)步問題。這也適用于基于 SPR 的傳感器。雖然仍然主要是基于研究的儀器，但便攜式表面等離子體共振設(shè)備已被證明對(duì)當(dāng)前的 SARS-CoV-2 大流行具有重要價(jià)值。SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組希望在這里展示傳統(tǒng) SPR 測(cè)試的一些缺點(diǎn)，諸如笨重的儀器及其在臨床環(huán)境中難以實(shí)施的問題，已通過這種小型化方法部分克服。它們的小型化特性與足夠的表面結(jié)構(gòu)相結(jié)合，使其能夠在 3 級(jí)生物安全條件下實(shí)施，以篩選新的生物受體對(duì)不同病毒表位的親和力，并產(chǎn)生一些敏感的 SARS-CoV-2 診斷平臺(tái)。憑借低至 10 PFU/mL 的高效 SPR 測(cè)試，它們可以被視為側(cè)流抗原測(cè)定的替代方案，其中賊高效的測(cè)試檢測(cè) 50 PFU/mL 相當(dāng)于約 3 × 10 它們的小型化特性與足夠的表面結(jié)構(gòu)相結(jié)合，使其能夠在 3 級(jí)生物安全條件下實(shí)施，以篩選新的生物受體對(duì)不同病毒表位的親和力，并產(chǎn)生一些敏感的 SARS-CoV-2 診斷平臺(tái)。憑借低至 10 PFU/mL 的高效 SPR 測(cè)試，它們可以被視為側(cè)流抗原測(cè)定的替代方案，其中賊高效的測(cè)試檢測(cè) 50 PFU/mL 相當(dāng)于約 3 × 10 它們的小型化特性與足夠的表面結(jié)構(gòu)相結(jié)合，使其能夠在 3 級(jí)生物安全條件下實(shí)施，以篩選新的生物受體對(duì)不同病毒表位的親和力，并產(chǎn)生一些敏感的 SARS-CoV-2 診斷平臺(tái)。憑借低至 10 PFU/mL 的高效 SPR 測(cè)試，它們可以被視為側(cè)流抗原測(cè)定的替代方案，其中賊高效的測(cè)試檢測(cè) 50 PFU/mL 相當(dāng)于約 3 × 10⁶RNA 拷貝/mL。多通道和多分析物分析的可能性可能會(huì)在臨床環(huán)境中為 SPR 提供額外的優(yōu)勢(shì)。在歐盟資助的項(xiàng)目 CorDial-S 下，至少以一種方法對(duì)臨床性能進(jìn)行了更密切的測(cè)試。對(duì) 119 份鼻咽拭子樣本的評(píng)估達(dá)到了 88% 的陽性百分比一致性 (PPA) 和 92% 的陰性百分比一致性 (NPA)。傳感器只能使用一次，因?yàn)楸砻娴脑偕鷷?huì)導(dǎo)致性能下降，即 86% 的正百分比一致性 (PPA) 和 82% 的負(fù)百分比一致性 (NPA)。有趣的是，表面的再生主要對(duì)負(fù)樣本產(chǎn)生了很大的影響，得到了假陽性反應(yīng)。在重復(fù)使用的接口上篩選的 50 個(gè)陰性樣本中，有 41 個(gè)被 RT-PCR 和 SPR 指定為陰性。

有了這些結(jié)果，SPR 在病毒檢測(cè)中的觀點(diǎn)是什么？基于 SPR 的生物傳感器的液體樣品體積和功耗仍然是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的主要瓶頸。為了克服這些缺點(diǎn)，必須考慮改進(jìn)和緊湊的微流體裝置，如無動(dòng)力泵系統(tǒng)，用于下一代基于 SPR 的集成生物傳感器。使用傳感盒是 Affinité Instruments 與SARS-CoV-2 病毒顆粒高效檢測(cè)方法重點(diǎn)攻關(guān)課題組一起為減少昂貴泵的實(shí)施而進(jìn)行的一項(xiàng)嘗試。這些一次性 SPR 傳感器是用于快速單點(diǎn)測(cè)量的低成本且易于使用的傳感設(shè)備。如果超靈敏度成為一個(gè)重要參數(shù)，則需要在該領(lǐng)域?qū)⒓{米材料集成到基于 SPR 的傳感器中。將磁場(chǎng)整合到 SPR 中并使用磁性粒子可能是改進(jìn)病毒傳感的一種方式。賊近研究了一種磁增強(qiáng) SPR (M-SPR)（未發(fā)表的數(shù)據(jù)），結(jié)果表明其檢測(cè)限低至 1.5 × 10^3個(gè)病毒顆粒mL ^-1，比常規(guī)SPR的檢測(cè)限低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，為5.9×10 ^{4 個(gè)}病毒顆粒mL ^-1。這個(gè)和其他概念將允許在未來推動(dòng) SPR 領(lǐng)域。

可以推斷，等離子方法也可能適用于 COVID 后危機(jī)，特別是為區(qū)分長(zhǎng)期 COVID 患者和其他患者提供診斷參數(shù)?，F(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，許多感染 SARS-CoV-2- 的患者會(huì)在賊初感染幾個(gè)月后出現(xiàn)急性后 COVID 綜合征。這一健康階段稱為長(zhǎng)期 COVID，發(fā)生在 30-50% 的 COVID-19 患者中，其特點(diǎn)是多系統(tǒng)癥狀、持續(xù)疲勞和認(rèn)知障礙，隨著年齡和女性性別的增加而更加普遍。盡管早期的印象是長(zhǎng)期 COVID 只能在住院和插管的患者中發(fā)展，但越來越多的證據(jù)表明，無論原始癥狀的嚴(yán)重程度如何，長(zhǎng)期 COVID 都可以發(fā)展 。

其他與本文內(nèi)容相關(guān)的科學(xué)證據(jù)：

Biosensors (Basel). 2022 Jul; 12(7): 548.

Published online 2022 Jul 21. doi: 10.3390/bios12070548

Plasmonic Approaches for the Detection of SARS-CoV-2 Viral Particles