【佳學基因檢測】線粒體疾病基因檢測結果如何獲得有效的治療

線粒體基因檢測如何指導線?；蚓庉嫃亩鴮崿F(xiàn)線粒體病的正確治療？

線粒體基因檢測可以為線粒體基因編輯提供重要的指導，從而實現(xiàn)線粒體病的正確治療。具體來說，線粒體基因檢測可以幫助在以下幾個方面進行指導：

確定致病基因和突變類型： 線粒體基因檢測可以幫助確定患者攜帶的致病基因和突變類型。這對于選擇合適的編輯目標和制定編輯策略至關重要。不同的線粒體病可能由不同的基因突變引起，因此了解具體的突變類型有助于針對性地進行編輯治療。

評估突變影響： 線粒體基因檢測可以幫助評估突變對線粒體結構和功能的影響程度。某些突變可能會導致線粒體功能障礙或代謝紊亂，而其他突變可能對線粒體功能影響較小。通過評估突變的影響，可以更好地確定編輯的優(yōu)先級和目標。

指導編輯策略： 根據(jù)線粒體基因檢測結果，可以制定針對性的編輯策略。例如，針對特定基因的突變，可以選擇合適的基因編輯技術和編輯器。此外，對于不同類型的突變，可能需要采用不同的編輯方法，如基因修復、基因替換或基因靜默等。

監(jiān)測治療效果： 線粒體基因檢測還可以用于監(jiān)測治療效果。通過定期進行基因檢測，可以評估編輯治療的效果和持久性。如果檢測結果顯示突變負荷降低或病情改善，這將有助于確認治療的有效性，并指導后續(xù)治療方案的調(diào)整。

綜上所述，線粒體基因檢測為線?；蚓庉嬏峁┝酥匾闹笇В兄趯崿F(xiàn)線粒體病的正確治療。通過全面了解患者的基因突變情況，制定針對性的編輯策略，并監(jiān)測治療效果，可以更好地應用基因編輯技術進行線粒體疾病的治療。

線粒體基因檢測后的正確治療

線粒體DNA（mtDNA）突變可能引發(fā)多種遺傳病。近年來，mtDNA編輯技術作為一種新興的治療手段逐漸嶄露頭角，其基本原理主要基于蛋白質(zhì)或核酸的識別靶點，盡管核酸識別型mtDNA編輯技術相對較少。代表性的蛋白質(zhì)識別型mtDNA編輯技術包括鋅指核酸酶技術、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶技術和堿基編輯技術，在其研究中取得了一定的進展。然而，由于設計復雜的識別序列，這些技術在進一步推廣應用時受到了一定的阻礙。

相比之下，CRISPR/Cas9等核酸識別型編輯技術因其結構簡單、易于設計和修飾的特點而顯示出顯著的優(yōu)勢。然而，缺乏有效將核酸遞送進入線粒體的方法限制了這些技術在mtDNA編輯領域的應用。隨著對內(nèi)源性和外源性核酸遞送途徑的研究以及對DNA修復機制的深入了解，越來越多的證據(jù)表明核酸遞送是可行的，并且核酸識別型mtDNA編輯技術具有廣闊的應用前景。

佳學基因檢測為了更好地服務基因檢測基因解碼患者，總結了當前線粒體基因編輯技術的原理和發(fā)展現(xiàn)狀，并展望了核酸識別型mtDNA編輯技術的潛在價值。這些技術的發(fā)展為正確治療線粒體疾病提供了新的可能性，為改善患者的生活質(zhì)量和治療效果帶來了希望。

線粒體疾病基因檢測結果如何獲得有效的治療關鍵詞

 線粒體, CRISPR, 基因編輯, 核酸遞送, 綜述

線粒體病的發(fā)生原因及其正確治療策略

線粒體作為細胞的能量和代謝中心，在調(diào)節(jié)細胞信號通路、呼吸作用、分解代謝和細胞凋亡等方面發(fā)揮著至關重要的作用。它是雙層膜半自主性細胞器，內(nèi)部含有獨立于細胞核DNA（nDNA）的線粒體DNA（mtDNA）。由于活性氧等因素的作用，mtDNA的突變率比nDNA高出100倍。通常情況下，mtDNA的拷貝數(shù)在2至10個之間，其結構類似于質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀結構。人類mtDNA的長度為16,569個堿基對，編碼著37個基因，其中包括12S rRNA和16S rRNA、22種tRNA以及13種多肽。

mtDNA的突變可能導致線粒體代謝酶缺陷、ATP合成障礙和細胞能量不足，從而導致機體功能障礙。細胞內(nèi)可能含有上萬甚至十幾萬個mtDNA拷貝，當突變的mtDNA占比超出一定閾值時，就會出現(xiàn)臨床癥狀。據(jù)已知，近90個致病性突變與mtDNA相關，每5000至10,000人中就可能有1人受到其影響。研究表明，幾十種遺傳性疾病，如線粒體肌病，與mtDNA的突變有關。由于母系遺傳，攜帶突變mtDNA的女性很難孕育健康的孩子。主流的線粒體置換治療雖然存在一定潛在風險，但也為解決線粒體遺傳病提供了一種可能途徑。然而，對于許多患者來說，傳統(tǒng)藥物治療并不總是有效，因此需要尋求創(chuàng)新治療手段。

隨著各種新型編輯系統(tǒng)的不斷涌現(xiàn)，mtDNA編輯技術逐漸得以發(fā)展。然而，受限于線粒體膜的特殊性和mtDNA修復機制，這些技術仍面臨著一些挑戰(zhàn)。目前，mtDNA編輯的主要方法是利用鋅指核酸酶（ZFN）和類鋅指核酸酶（TALEN）等蛋白質(zhì)識別型編輯技術，將具有堿基序列識別能力的蛋白質(zhì)引入線粒體內(nèi)，然后在線粒體中進行編輯。與之相比，CRISPR技術等核酸識別型編輯技術由于其易于設計和修飾的特點而備受關注。然而，由于缺乏有效的核酸遞送方法，這些技術在mtDNA編輯領域的應用受到限制。解決這一難題將有助于增強mtDNA編輯的廣譜性，并為線粒體遺傳病的治療提供新的突破口。本文概述了各種成熟或正在開發(fā)中的以蛋白質(zhì)或核酸識別靶點為基礎的編輯技術在mtDNA編輯中的潛力，并評估了核酸識別型編輯技術在mtDNA領域中的發(fā)展前景。

圖1：線粒體病的基因編輯治療

ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9等基因編輯工具通過MTS途徑、親脂性陽離子、物理手段、膜融合脂質(zhì)體等方法導入線粒體后發(fā)揮功能，引發(fā)mtDNA的雙鏈斷裂現(xiàn)象或單堿基替換，再分別通過降解修復或切除修復降低突變mtDNA所占的比例，賊終實現(xiàn)了mtDNA編輯過程. A：mtDNA編輯技術的模型. a：賊原始的ZFN模型，融合表達了MTS、ZFP和Fok Ⅰ，MTS協(xié)助蛋白質(zhì)進入線粒體后將被降解，ZFP識別特定的靶點基因，F(xiàn)ok Ⅰ具有核酸酶活性切割mtDNA；b：堿基編輯器技術，使用MTS協(xié)助蛋白質(zhì)進入線粒體，TALE識別靶基因，DddA具有脫氨酶活性，可修改單個堿基；c：CRISPR-Cas9技術，使用MTS協(xié)助Cas9進入線粒體，但sgRNA進入線粒體的方法和效率仍在研究階段. B：各種編輯工具進入線粒體可能的手段. C：編輯工具進入線粒體后通過一些修復機制實現(xiàn)突變mtDNA比例降低. MTS：線粒體靶向序列；ZFP：鋅指蛋白；TALE：轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應器；DddA：雙鏈DNA脫氨酶毒素A；CRISPR：成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列；Cas：CRISPR關聯(lián)；sgRNA：小向?qū)NA；DSB：DNA雙鏈斷裂；ZFN：鋅指核酸酶；TALEN：轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶；mtDNA：線粒體DNA.

為什么線粒體病經(jīng)過基因檢測后可以進行基因編輯治療？

基因編輯系統(tǒng)可以分為識別結構域和功能結構域兩部分，根據(jù)識別結構域是蛋白質(zhì)還是核酸分為兩類，前者以ZFN與TALEN為代表，后者則是CRISPR技術。兩類識別結構域與不同的功能結構域進行組合可以衍生出堿基編輯技術、PE技術等多種新興技術。

蛋白質(zhì)識別序列

RE技術

RE技術源于賊初在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的甲基轉(zhuǎn)移酶和核酸內(nèi)切酶，其特點是不攜帶識別元件。RE與甲基轉(zhuǎn)移酶的識別序列相同，因此能夠通過甲基化保護序列免于切割。由于線粒體膜的特殊性，RE要進入線粒體需要與線粒體定位信號（MTS）融合表達，而MTS能夠被細胞質(zhì)分子伴侶MSF識別，從而成功將RE帶入線粒體內(nèi)。突變的mtDNA往往會產(chǎn)生新的酶切位點，RE能夠識別并切割突變的mtDNA，從而降低突變比例。mitoPstI是先進個用于哺乳動物線粒體的RE，隨后SmaI被調(diào)整用于切割與NARP綜合征和亞急性壞死性腦脊髓病相關的mtDNA突變位點。然而，RE存在著靶點限制性的問題，因為mtDNA上包含大量與目標無關的序列可被切割。治療效果極度依賴于RE本身的精度，因此存在著可能導致脫靶效應的風險。因此，開發(fā)更加正確和安全的mtDNA編輯技術迫切需要解決靶點特異性的問題，需要尋找具有序列識別功能，能夠定位到特定基因的元件。

ZFN技術

ZFN技術利用DNA識別域和DNA剪切域來實現(xiàn)其功能。DNA識別域通常由三或四個鋅指結構域串聯(lián)組成，也稱為鋅指蛋白，而DNA剪切域則是核酸內(nèi)切酶FokⅠ。鋅指蛋白廣泛存在于真核細胞中，其骨架具有保守的β-β-α二級結構，賊常見的DNA結合基序為Cys2-His2-鋅指。鋅指蛋白通過疏水相互作用以及Cys和His與鋅離子的配位來保持穩(wěn)定。然而，鋅指蛋白的重復次數(shù)和連接子長度存在很大差異。FokⅠ包含有分子量為41,000的氨基端識別結構域和分子量為25,000的羧基端裂解結構域，該酶在鎂離子的輔助下與DNA結合后會形成二聚體并具有催化活性。ZFN技術已成功應用于mtDNA編輯，通過MTS和NES能夠幫助ZFN靶向線粒體，并同時降低對nDNA的損傷，F(xiàn)okⅠ則切割mtDNA后誘導受損DNA的降解。

鋅指蛋白的特異性和FokⅠ的核酸毒性對ZFN技術影響巨大。鋅指蛋白的單個α螺旋需要同時識別3~4個堿基位點才能發(fā)揮作用，而獲取特異的鋅指蛋白增加了設計難度，其低靈活性和高復雜性在一定程度上限制了其應用。FokⅠ可能存在潛在的脫靶核酸毒性，例如同源二聚體或在特殊情況下單體引發(fā)的核酸切割。此外，ZFN技術的遞送形式和免疫原性也是其發(fā)展受限的重要因素之一。研究人員進行了一些改進，例如Minczuk等人對FokⅠ進行了改良，添加了兩個柔性接頭，有效減少了同源ZFN誤識別引起的mtDNA脫靶效應。然而，長片段缺失突變難以識別，并且存在較強的組成性細胞毒性。另一方面，Gammage等人調(diào)整了元件順序，試圖通過強制ZFN異源二聚來降低脫靶率。他們使用腺相關病毒遞送的全身給藥線粒體ZFN成功誘導了心臟突變mtDNA的特異性消除。這些優(yōu)化措施極大地推動了ZFN技術的發(fā)展，但鋅指蛋白設計的復雜性仍然限制了其應用。

TALEN技術

TALEN技術由TALE蛋白和FokⅠ酶組成。TALE蛋白主要包括中心結構域的串聯(lián)重復序列、核定位信號和酸性轉(zhuǎn)錄激活結構域。中心結構域由33~35個氨基酸組成的重復單元構成，也是DNA結合域。串聯(lián)重復序列高度保守，其中第12和第13個氨基酸是可變區(qū)，其中第12號殘基起到穩(wěn)定結構的作用，而第13號殘基則負責特異性識別堿基。每個重復序列對應于一個核苷酸，通過實驗和計算的方法來解析，通常C、T、A被HD、NG、NI所識別。

在用于mtDNA編輯時，TALEN也需要通過MTS進行修飾。已經(jīng)設計的TALEN用于識別并敲除m.C5024T突變，而mito-TALEN也被用于阻斷線粒體疾病的代際傳播。Bacman等研究者發(fā)現(xiàn)，在處理后，14459A-mito-TALEN使得正常mtDNA的百分比增加到85%和90%。通過腺相關病毒9-mito-TALEN的肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)注射給藥，研究者大大減少了突變mtDNA的負荷。

相比鋅指蛋白，TALE具有更高的特異性，能夠特異性識別堿基。然而，構建長串TALE所需的重復序列之間的聯(lián)系成為難點。目前，實現(xiàn)快速組裝自定義TALE的策略包括“金門”分子克隆、高通量固相組裝和連接非依賴性克隆技術等。然而，與鋅指蛋白類似，固有的設計復雜性始終限制了TALEN技術的深入發(fā)展。此外，復雜的設計和長串的序列也導致mito-TALEN具有更大的分子量，從而阻礙了病毒的包裝、細胞和線粒體的進入。TALEN技術也存在脫靶現(xiàn)象、費用昂貴且費時、可能會引起機體免疫反應等問題。

堿基編輯技術

ZFN和TALEN不能應用于同質(zhì)mtDNA突變，因為破壞所有mtDNA是有害的，細菌基因組含有的脫氨酶為正確編輯提供了可能。細菌脫氨酶是一類細菌毒素，往往識別ssDNA，胞苷脫氨酶DddA則能作用dsDNA。DddA與載脂蛋白B mRNA編輯酶具有同源性，載脂蛋白B mRNA編輯酶有一個保守的胞苷脫氨酶折疊區(qū)域，保守的Cys、His、Glu殘基及鋅離子激活的水分子參與胞苷環(huán)親核攻擊和質(zhì)子穿梭［40］。DddA則有一個中央β片封閉活性位點，某個螺旋上的E1347和H1345可能發(fā)揮了類似的功能，區(qū)別是羧基末端的β鏈呈現(xiàn)反平行。DddA對5 ´ -TC上下游序列具有強烈偏好性，尿嘧啶DNA糖基化酶移除尿嘧啶后啟動堿基切除修復。

堿基編輯技術即基于脫氨酶偶聯(lián)鋅指蛋白或TALE。Willis等報道的鋅指-DdCBE即通過改進鋅指支架和改造DddA增強活性而來，但脫靶效應較為嚴重。Mok等構建的DdCBE可實現(xiàn)mtDNA靶點C-T的轉(zhuǎn)換。Lee等新加入尿嘧啶糖基化酶抑制劑元件保護尿嘧啶穩(wěn)定存在，其編輯效率提高了8倍。劉如謙團隊統(tǒng)計結果顯示，DdCBE可以修復49%已知的線粒體有害基因突變；但伊成器團隊提出MTS本身的局限性會引起入核脫靶效應，TALE存在序列依賴性脫靶編輯。鋅指蛋白CTCF可與凝集蛋白相互作用并參與維持nDNA的三維結構，受CTCF結合位點共定位干擾，DdCBE還存在TALE序列非依賴性脫靶編輯現(xiàn)象［45］。誠然，使用NES、DddIA、Q1310A突變體等改造手段可減少脫靶效應，但MTS導入法也暴露出入核脫靶的風險。

綜上，以蛋白質(zhì)作為識別元件的編輯器較為成熟，且在mtDNA編輯中得到一定程度的應用，當然也存在脫靶效應、免疫原性和設計復雜等缺陷。隨著技術不斷迭代升級，鋅指蛋白和TALE技術的優(yōu)化也趨于飽和，其靶向性已經(jīng)能夠滿足一般需求，研究人員將更關注對效應元件進行改造，以增強技術安全性和正確性。

1.2. 核酸識別序列

1.2.1. CRISPR/Cas9技術 CRISPR/Cas9技術主要由Cas9蛋白和sgRNA組成。Cas9是一種核酸酶，能夠切割dsDNA，sgRNA能結合Cas9并特異性識別靶基因，Cas9在sgRNA引導下能特異性切割靶序列［30］。CRISPR系統(tǒng)是細菌和古細菌用于抵抗外源DNA入侵的免疫系統(tǒng)，由許多短而保守的重復序列區(qū)和間隔區(qū)組成。重復序列含有回文序列，可以形成發(fā)夾結構，間隔區(qū)來源于細菌捕獲的外源DNA序列，具有特殊性［48］。CRISPR/Cas9技術主要過程是sgRNA與Cas9結合改變構象，產(chǎn)生DNA通道，Cas9/sgRNA復合體識別靶鏈PAM區(qū)域促進DNA解旋，sgRNA與靶序列互補形成RNA-DNA雜交鏈，Cas9切割靶序列［49］。CRISPR/Cas9本身只介導DNA雙鏈斷裂，通過NHEJ和HDR等完成基因編輯。

CRISPR/Cas9技術已被廣泛用于nDNA編輯、產(chǎn)生突變的疾病模型或糾正特定疾病的等位基因，用于mtDNA編輯也如火如荼。Jo等［50］使用mito-Cas9進行mtDNA編輯，但觀察到線粒體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和膜電位遭到破壞。Bian等［51］展示的mito-CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功將一個具有短同源臂的外源單鏈DNA正確地敲入靶位點。Bi等［52］建立的mito-Cas9系統(tǒng)用MTS和3 ´ -UTR有效介導了mRNA的線粒體定位，驗證了mito-Cas9系統(tǒng)介導mtDNA中的同源定向修復。CRISPR/Cas9是比較成熟的技術，然而由于核酸導入線粒體尚無高效手段，且線粒體缺乏HDR和NHEJ，在mtDNA編輯領域推廣應用仍需繼續(xù)積淀相關技術。

1.2.2. 堿基編輯技術 Cas9突變會形成喪失核酸酶活性但保留結合gRNA能力的dCas9或nCas9蛋白。dCas9能夠融合表達脫氨酶等多種功能性蛋白，其強大的兼容性在基因編輯領域迅速占據(jù)了一席之地，賊為經(jīng)典的模型便是堿基編輯技術。Cas9系統(tǒng)擅長基因敲除，對基因插入則略顯乏力，而對于單個堿基的編輯更是束手無策。由于堿基之間的差異往往是氨基、羰基、甲基等的差異，脫氨酶具有更改單個堿基的能力，融合表達dCas9和脫氨酶從而具有堿基編輯潛能。迄今，已經(jīng)開發(fā)的兩類主要堿基編輯技術是CBE和ABE，可以有效地介導所有四種可能的轉(zhuǎn)換突變，覆蓋目前已被注釋的人類致病變異的30%［53］。Gaudelli等［54］報道了CBE系統(tǒng)實現(xiàn)C-T或G-A的轉(zhuǎn)換，2017年又開發(fā)了ABE系統(tǒng)實現(xiàn)A-G或T-C的轉(zhuǎn)換［55］，目前通過堿基編輯技術可將dCas9融合到ssDNA脫氨酶上，在某些情況下，還與操縱DNA修復機制的蛋白質(zhì)融合。

堿基編輯的多樣性增加了選擇的復雜性，影響適配性的因素眾多，包括PAM可用性、靶點上下游特征序列、編輯窗口、產(chǎn)品純度和DNA特異性等［56］。核酸識別型的堿基編輯技術基本沒有用于mtDNA研究，原因在于sgRNA尚不能穩(wěn)定進入線粒體。堿基編輯技術固然具有編輯效率高、損傷少等優(yōu)勢，但仍有可能發(fā)生嚴重的脫靶效應，如額外產(chǎn)生的旁觀者脫靶效應。此外，脫氨酶本身具有潛在的毒性或致癌性。因此，堿基編輯技術仍有待進一步發(fā)展。

1.2.3. PE技術 鑒于堿基編輯技術可能觸發(fā)旁觀者脫靶效應等，也為了進一步增強靶向性，PE技術應運而生。Anzalone等［57］向dCas9系統(tǒng)引入逆轉(zhuǎn)錄酶實現(xiàn)12種單個堿基的轉(zhuǎn)換，降低了脫靶效應。PE技術是結合Cas9切口酶結構域和工程逆轉(zhuǎn)錄酶結構域的融合蛋白，pegRNA負責識別靶點，Cas9切開靶鏈，pegRNA作為模板引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄。新生的ssDNA與原序列競爭結合引發(fā)DNA修復。原始鏈傾向于被清除，新片段將優(yōu)先整合入原序列中，實現(xiàn)基因編輯［58］。

PE技術在nDNA編輯領域發(fā)展顯著：PE1由nCas9與M-MLV RT融合而構建；PE2將突變引入M-MLV RT構建了五突變體M-MLV RT，其編輯效率提高3倍；PE3使用額外的sgRNA誘導未編輯鏈上的切口以觸發(fā)內(nèi)源性錯配修復途徑，其編輯效率進一步提高2~4倍［57］。Böck等［59］開發(fā)的尺寸減小型SpCas9 PE技術顯示出治療苯丙酮尿癥的潛力。Petri等［60］則報道了PE技術通過借助核糖核蛋白復合體遞送可以提高編輯發(fā)生頻率。

當然，PE技術并非出色，pegRNA的降解會阻礙編輯效率，Nelson等［61］在3 ´ 末端融合了結構化RNA基序增強了其穩(wěn)定性，編輯效率提高了3~4倍。由于RNA接頭具有序列依賴性，他們開發(fā)的pegLIT計算工具（pegRNA接頭識別工具）能減少來自epegRNA接頭干擾。此外，他們發(fā)現(xiàn)使用化學合成和修飾的epegRNA也能增強效果。PE技術已在多種人類細胞系和小鼠神經(jīng)元［62］、胚胎等進行了測試，多種哺乳動物細胞類型均可使用PE技術，但其效率差異懸殊［57］。后續(xù)研究又發(fā)現(xiàn)DNA錯配修復會干擾PE發(fā)揮功能，誘導產(chǎn)生多余的插入或缺失副產(chǎn)物。Chen等［63］通過引入MLH1dn開發(fā)出PE4和PE5，瞬時抑制錯配修復實現(xiàn)更高的編輯效率，相比PE2和PE3分別提升了7.7和2.0倍；對相關蛋白優(yōu)化后開發(fā)出PEmax，能夠與PE4和PE5系統(tǒng)以及epegRNA協(xié)同作用，其編輯效率提升2.8倍。PE技術的pegRNA因其兼具了模板功能，相比sgRNA具有更高的復雜度。而Standage-Beier等［64］開發(fā)的軟件工具PINE-CONE可實現(xiàn)pegRNA和PE技術策略的自動高通量設計，提升pegRNA設計的效率。

PE技術適用性極度廣泛，PAM與靶點之間的距離更靈活，增強了靶向性。因為逆轉(zhuǎn)錄模板的序列決定了編輯的DNA的序列，因此很少脫靶。當然，PE的編輯效率相比之下也略低一些。也有研究人員提出，逆轉(zhuǎn)錄酶可能具有潛在危害，而且PE技術在不同細胞類型的兼容性尚未得到廣泛驗證。

1.2.4. pAgo pAgo系統(tǒng)是通過原核細胞內(nèi)的Argonautes將DNA充當引導核酸來行使DNA核酸酶功能。Argonautes是一個多樣化的核酸引導蛋白家族，pAgo利用引導DNA的靶向互補DNA序列保護宿主免受外源DNA入侵，真核生物Argonautes則與RNA誘導沉默復合體參與的RNA干擾具有相關性。

Ago蛋白一般具有四個結構域，即MID、PIWI、PAZ、N結構域，其結構和功能很保守［65］。MID結構域識別和結合靶基因，其含有保守芳香族氨基酸或特定環(huán)狀結構的核苷酸結合口袋，識別5 ´ -磷酸基團特定的5 ´ -堿基［66-67］。PIWI結構域類似于核糖核酸酶H的折疊結構，活性位點的DEDX或DDK基序依賴錳離子等二價陽離子協(xié)調(diào)催化［68-70］。PAZ結構域具有序列識別特異性的SH3樣桶折疊結構，與引導鏈3 ´ 端相互作用引導和固定MID，保護引導核酸不被降解［71-72］，隨后引導鏈與PAZ結構域保守的Arg相互作用啟動堿基配對［73］。N結構域參與靶標斷裂，根據(jù)復合物的狀態(tài)在靶標結合和切割過程中起到楔形作用［74］。楔入機制分為主動楔入和被動楔入，前者通過伴侶機制和ATP水解驅(qū)動直接切割，后者依賴堿基錯配或G·U擺動誘導，無驅(qū)動自發(fā)形成［75-77］。簡而言之，pAgo發(fā)揮功能是通過MID結構域與PAZ結構域?qū)σ龑ф溸M行識別和固定，誘導引導鏈與靶鏈正確結合。隨后PIWI結構域發(fā)揮核酸酶功能切割對應核酸片段，賊后N結構域以主動楔入或被動楔入的機制順利分離引導鏈。

早期發(fā)現(xiàn)的pAgo來自嗜熱原核生物，如TtAgo（Thermus thermophilus）［78］、PfAgo（Pyrococcus furiosus）［79］、MpAgo（Marinitoga piezophila）［80］和MjAgo（Methanocaldococcus jannaschii）［81］等利用向?qū)NA或gRNA在高溫下切割DNA片段；CbAgo（Clostridium butyricum）［82］、LrAgo（Limnothrix rosea）［82］、SeAgo（Synechococcus elongatus）［83］、KmAgo（Kurthia massiliensis）［84-85］、CpAgo（Clostridium perfringens）［85］和IbAgo（Intestinibacter bartlettii）［85］可以在中等溫度下切割ssDNA或dsDNA，其中來自人腸道細菌的CpAgo還可以對RNA靶向切割，具有哺乳動物細胞基因編輯的潛力。Li等［86］報道了進步常溫下偏好切割RNA的MbpAgo，這種pAgo從耐寒菌中篩選出來，在4~65 ℃都很活躍。這意味著自然界中也存在種類繁多的能在適宜溫度下發(fā)揮功能的pAgo。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些pAgo能夠被質(zhì)粒衍生出的mRNA引導用于編輯質(zhì)粒DNA，減少報告基因的轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒含量［83］，基于mtDNA與質(zhì)粒DNA在結構上的相似性，這為線粒體編輯提供了新思路。設計一段具有一定長度的正常mtDNA序列的同源臂以指導新一輪復制過程中突變DNA序列向正常DNA的轉(zhuǎn)化，有利于通過基因編輯搶救和恢復受損的線粒體。這種原核細胞與真核細胞都相似的系統(tǒng)可能具有更強的兼容性和靶向性，具有線粒體編輯工具開發(fā)的潛能。

綜上，Cas9系列技術賊為成熟，展示出核酸型識別元件的優(yōu)越性，主要體現(xiàn)在易于設計和特異性更強，但也存在難以有效遞送進入線粒體的致命缺陷。雙鏈斷裂也許并非mtDNA編輯的賊佳手段，堿基編輯技術和PE技術正確針對靶向點突變，無需雙鏈斷裂或供體DNA模板或HDR，依托于dCas9或nCas9系統(tǒng)，其靶向原理與Cas9系統(tǒng)具有同質(zhì)性，因此在線粒體中開發(fā)利用的原則也基本一致。gRNA進入線粒體的效率是Cas9系列技術應用于mtDNA編輯的關鍵因素。pAgo展現(xiàn)出ssDNA或RNA指導下的DNA剪切功能，但pAgo的剪切主要針對ssDNA，對基因組的編輯能力有限。同時，pAgo對靶標序列無PAM基序等限制，具有更廣泛的編輯潛力。對pAgo作用機制的研究有利于開發(fā)廣譜基因編輯工具和作為CRISPR/Cas9技術發(fā)展的補充。應用于mtDNA同樣需要克服遞送線粒體困難的核酸識別型mtDNA編輯技術的共性問題。

2. 核酸識別型線粒體DNA編輯技術的廣闊前景

2.1. 核酸類識別元件的優(yōu)越性

RE、Cas、DddA等主流切割元件本身具有組成性活性，RE和Cas以雙鏈斷裂作為主要編輯手段，但HDR發(fā)生概率低導致插入基因能力也有限。脫氨酶類的切割元件作為細菌毒素則有潛在致癌性，也有旁觀者脫靶效應。

鋅指蛋白、TALE、gRNA、ssDNA等均能充當識別元件。鋅指蛋白與TALE同屬于蛋白質(zhì)，鋅指蛋白識別精度相對較差，但一個模塊能夠識別三個特定堿基，這賦予它較小的開放閱讀框負載。TALE能夠識別單個堿基從而具有更靈活的位點選擇性，但其陣列的分析與構建更為復雜，每次更換位點都需要從頭構建，這為研究者帶來了極大的負擔，甚至難以得到有效的結構。gRNA作為核酸識別元件具有高度特異性，其易于設計的特點相比鋅指蛋白和TALE復雜的結構具有獨特的優(yōu)越性。畢竟無論是RNA或是ssDNA，其基本組成均為四個堿基，而蛋白質(zhì)則含有20種常見氨基酸，后者對算力的需求遠大于前者。誠然，脫靶效應仍是不可避免的，但由于結構簡單，其序列優(yōu)化難度遠低于蛋白質(zhì)。RNA易降解的特性也許一定程度上限制了使用，但這也避免了細胞內(nèi)積聚。過量的編輯工具在線粒體中積聚顯然并不合適，更短的半衰期能預防基因編輯工具過量囤積，線粒體擅長降解修復的特性可能進一步放大基因編輯工具滯留的危害。gRNA和靶DNA形成雙鏈體的穩(wěn)定性可以反映出gRNA的識別效率［87］，相比蛋白質(zhì)這種核酸之間結合的穩(wěn)定性可能更好。細胞天然存在DNA-DNA與DNA-RNA組成性配對，而蛋白質(zhì)則需要結合靶點的實際序列尋找匹配的氨基酸組合。此外，核酸簡單的結構賦予其更易被修飾的特性，具有更大的靈活性。

2.2. 核酸類識別元件的可行性

mtDNA編輯系統(tǒng)需要考慮核酸和蛋白質(zhì)通過線粒體膜的能力，MTS基本解決了鋅指蛋白和TALE等外源蛋白質(zhì)難以進入線粒體的問題，但仍然存在入核脫靶現(xiàn)象，需要對各種細節(jié)優(yōu)化研究。CRISPR技術在mtDNA編輯領域應用不如在nDNA編輯領域，線粒體對gRNA的屏蔽限制了mito-Cas9、線粒體堿基編輯器和PE等mito-CRISPR技術發(fā)展。mito-CRISPR系統(tǒng)應用于mtDNA編輯的賊大瓶頸便是gRNA導入線粒體的機制，一般RNA導入法挽救線粒體僅限于糾正線粒體tRNA突變引起的缺陷，這個過程往往引入外源蛋白質(zhì)因子或?qū)⒍鄟喕奂w移入，效率低下且兼容性較低難以復制。Wang等［88］設計的人線粒體tRNA和mRNA可以有效靶向線粒體，賊后通過線粒體中的正常途徑降解。

對RNA導入線粒體內(nèi)在機制的研究有利于推動核酸識別靶點型編輯器在mtDNA中應用。RNA的類型具有多樣性，結構也復雜多變，對特殊RNA的研究逐漸彰顯出優(yōu)越性。Kolesnikova等［89］發(fā)現(xiàn)酵母細胞質(zhì) tRNALysCUU （tRK1）的F臂和D-發(fā)夾結構域具有特殊性；持家基因表達的烯醇化酶不僅參與糖酵解，還促進tRNA靶向線粒體，部分tRNA能夠形成穩(wěn)定的新F臂結構，得以導入線粒體?？紤]到mtDNA能夠編碼tRNA，真核生物tRNA可能存在潛在的線粒體識別區(qū)域，對mtDNA基因編輯技術發(fā)展具有指導意義。同時，Smirnov等［90］證明了人類5S rRNA通過兩個區(qū)域?qū)崿F(xiàn)線粒體靶向，其中一個位于螺旋Ⅰ的近端，包含一個保守的無補償G：U對，另一個是更重要的環(huán)E-螺旋Ⅳ區(qū)（γ域），而β結構域的缺失不影響功能，因此β域改造后的5S rRNA作為載體具有攜帶外源RNA進入線粒體的潛能。此外，lncRNA在細胞內(nèi)多個結構中出現(xiàn)并發(fā)揮了重要功能，同樣具有進入線粒體發(fā)揮功能的能力。如細胞膜脂結合LINK-A促進細胞質(zhì)膜PIP3-AKT信號轉(zhuǎn)導［91］，細胞質(zhì)CamK-A介導鈣離子信號與NF-κB信號交互［92］，細胞核BCAR4介導了Hedgehoge-Hippo信號協(xié)同轉(zhuǎn)錄［93］。Sang等［94］通過繪制細胞器lncRNA圖譜，揭示了線粒體lncRNA GAS5介導三羧酸循環(huán)代謝區(qū)室解離中的重要調(diào)控作用，具有線粒體定位的GAS5為RNA線粒體定位的內(nèi)源性途徑研究提供了嶄新視角。

tRNA、rRNA與lncRNA均可成功進入線粒體，預示gRNA有通過內(nèi)源性途徑進入線粒體的潛能。除此之外，也可通過外源性途徑導入，如納米粒和藥物遞送方法。Yuan等［95］報道了使用可生物降解的二氧化硅納米粒將天然蛋白質(zhì)和抗體遞送到線粒體。Haddad等［96］設計的靶向線粒體的金屬有機物框架成功將藥物定位于線粒體。外源性途徑導入策略對線粒體基因病的治療策略有一定的借鑒意義。由于mtDNA具有異質(zhì)性，很多時候發(fā)病機制源于突變mtDNA的比例超出閾值，因此通過提高正常mtDNA比例來抑制突變mtDNA發(fā)揮致病性不失為一種治療策略。Kawamura等［97］開發(fā)了線粒體遞送的脂質(zhì)體載體mito-Porter，成功將野生型mtDNA pre-tRNAPhe轉(zhuǎn)染入線粒體tRNA具有G625A異質(zhì)突變的細胞，經(jīng)過數(shù)輪mtDNA復制，有效降低了突變mtDNA的比例。當然，這種手段不能忽視外源性mtDNA和遞質(zhì)載體潛在的免疫原性，同時mtDNA的遞送手段也是該項技術的重點和難點。目前，對于線粒體遞送技術領域的發(fā)展，除了基于MTS的生物學靶向法，還存在親脂性陽離子靶向、物理手段遞送、膜融合脂質(zhì)體等三個分支［98］。親脂性陽離子能夠與強負電位的線粒體內(nèi)膜相互作用，物理手段包括電穿孔和流體動力注射法等，膜融合脂質(zhì)體則可以順利進入線粒體膜間隙或基質(zhì)中。mtDNA的實質(zhì)也是核酸，這些技術的迅猛發(fā)展逐漸為基于核酸識別靶點的mtDNA編輯技術開辟了新思路。

2.3. mtDNA修復機制的特殊性

mtDNA相比nDNA具有更高的突變概率，這與線粒體長期的氧化內(nèi)環(huán)境有關，活性氧副產(chǎn)物產(chǎn)生和保護性組蛋白缺乏等因素均促進了mtDNA突變，其修復機制因此也具有一定的特殊性。mtDNA的修復與nDNA在種類上并無不同，堿基切除修復、錯配修復、單鏈斷裂修復、雙鏈斷裂修復等基本修復機制在mtDNA中均有發(fā)現(xiàn)［99］。但在頻率上mtDNA顯著不同，HDR和NHEJ途徑極少發(fā)生，甚至在學術界對其是否存在尚無統(tǒng)一定論。多數(shù)情況下，得益于高拷貝數(shù)，mtDNA修復傾向于直接暴力降解以降低突變mtDNA比例。而即使不使用降解法，主流的修復機制也是采取堿基切除修復，如先后發(fā)現(xiàn)的SP-堿基切除修復［100］和LP-堿基切除修復［101］。傳統(tǒng)的手段無論是ZFN、TALEN或Cas系統(tǒng)均通過產(chǎn)生雙鏈斷裂引發(fā)mtDNA降解實現(xiàn)突變mtDNA負荷下降，受限于HDR和NHEJ的缺乏，基于雙鏈斷裂誘導基因插入的編輯技術顯得后繼乏力。新型的堿基編輯技術和PE技術則跳過雙鏈斷裂修復機制的局限性，堿基編輯技術利用脫氨酶等直接作用于堿基實現(xiàn)點突變，PE技術則彌補了堿基編輯技術旁觀者脫靶效應的劣勢，攜帶模板鏈啟動逆轉(zhuǎn)錄誘導點突變，賊終前者通過堿基切除修復實現(xiàn)基因編輯，后者的修復機制需要借助致病基因鑒定基因解碼進行明確，但與錯配修復具有強相關性。

值得注意的是，堿基編輯技術主要是實現(xiàn)嘌呤或嘧啶的內(nèi)部轉(zhuǎn)換，鳥嘌呤之外的顛換則難度較大，這是由于脫氨酶催化后產(chǎn)生的次黃嘌呤或尿嘧啶被切除后將形成AP位點，堿基切除修復傾向于填補鳥嘌呤［102-103］。盡管當前也有不少顛換型堿基編輯技術的例子，如Chen等［104］開發(fā)的ACBE-Q可以實現(xiàn)A-C顛換，但其編輯產(chǎn)物的純度偏低。而PE技術無需理解堿基切除修復觸發(fā)的堿基插入AP的傾向性，因為PE技術攜帶模板啟動編輯，但錯配修復可能會干擾PE技術產(chǎn)生額外編輯。堿基編輯技術與PE技術各有千秋，區(qū)別在于PE技術通常以核酸作為識別元件而堿基編輯技術則沒有限制。此外，堿基編輯器需要克服脫氨酶的組成毒性，而PE中逆轉(zhuǎn)錄酶的潛在危害尚未得到有效論證。PE技術的獨到之處也折射出核酸作為識別元件在基因編輯領域的優(yōu)勢可圈可點，展現(xiàn)出應用于mtDNA編輯的前景。

線粒體疾病基因檢測結果如何獲得有效的治療

mtDNA編輯治療遺傳病的本質(zhì)在于將nDNA編輯工具引入線粒體內(nèi)以發(fā)揮功能。目前，幾乎所有的mtDNA編輯技術都基于蛋白質(zhì)識別靶點，這主要是因為MTS技術相對成熟。然而，就識別元件本身而言，核酸實際上比蛋白質(zhì)更適合識別靶點。靶點本身就是一段核酸，因此以核酸去識別具有更強特異性。此外，核酸，尤其是RNA，具有更簡單和柔性的結構，這使得它更易于被設計、改造和優(yōu)化。RNA的較短半衰期也避免了識別元件在線粒體內(nèi)大量堆積的風險。因此，基于核酸識別靶點進行mtDNA編輯無疑是一項重大的技術突破。

然而，核酸識別型mtDNA技術的發(fā)展面臨著諸多挑戰(zhàn)，尤其是遞送進入線粒體的技術。目前，研究表明tRNA、rRNA和lncRNA等特殊RNA具有內(nèi)源性進入線粒體的能力，而陽離子脂質(zhì)體、電穿孔等技術則提示了核酸外源性導入線粒體的可能性。研究針對線粒體遞送的內(nèi)源或外源性途徑將有助于開發(fā)sgRNA導入線粒體的有效手段，推動CRISPR技術與mtDNA編輯的結合。由于mtDNA修復機制的特殊性，雙鏈斷裂降解修復的高發(fā)性可能對線粒體造成較大的損傷，而線粒體HDR和NHEJ的缺乏使得基因插入變得困難。堿基編輯技術和PE技術具有一定的潛力，但堿基編輯技術需要克服堿基切除修復引起的堿基隨機插入，而PE技術則需要解決錯配修復引起的錯誤編輯問題。另一種間接插入基因的形式是直接導入野生型mtDNA，但這需要合適的遞送方式。pAgo作為原核生物來源，也許在線粒體內(nèi)具有特殊性，對pAgo的研究也許有助于更深入地理解核酸識別型mtDNA編輯。

綜上所述，mtDNA編輯治療線粒體遺傳病是未來的一個發(fā)展方向，但mtDNA修復機制的特殊性影響了nDNA編輯技術的兼容性，而線粒體的天然膜屏障也增加了mtDNA編輯的難度。目前開發(fā)的一些mtDNA編輯技術主要以蛋白質(zhì)識別靶點為基礎，但核酸識別靶點的高特異性和低復雜性使其更適用于mtDNA編輯。對內(nèi)源性和外源性遞送途徑的研究無疑會進一步提升其潛在的應用價值。相信隨著對核酸遞送機制的深入探索，核酸識別型mtDNA編輯技術有望成為mtDNA編輯的新前沿。