【佳學(xué)基因檢測】血液系統(tǒng)疾病的基因矯正治療

遺傳病、罕見病基因檢測導(dǎo)讀：

佳學(xué)基因在掌握了造血干細胞（HSCs）的分離和擴增特性以后，可以對免疫系統(tǒng)及造血系統(tǒng)進行修改和重建，從而在細胞和基因治療發(fā)展的前沿開展研究和產(chǎn)業(yè)化工作。基因組編輯技術(shù)的最新進展，特別是聚集的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）和CRISPR/Cas衍生的編輯系統(tǒng)，改變了基因治療的格局。這一工具系統(tǒng)應(yīng)用的靈活性及其在基因的失活、矯正及插入方面的應(yīng)用拓寬了可以進行基因治療的靶標(biāo)，使得我們可以通移植經(jīng)過修改的造血干細胞來開發(fā)一系列罕見疾病的治療方案?；虺C正技術(shù)和特色在于更高的編輯效率和更正確的基因修改位置，治療方案的可耐受性更好，更容易運輸進行異地治療及更低的治療費用。為了得到患者、監(jiān)管機構(gòu)及社會大眾對這一先進治療方案的理解，佳學(xué)基因綜述了造血干細胞的基因編輯在遺傳病治療方面的進展。介紹了這一技術(shù)的臨床前實驗及臨床研究中最有意義的發(fā)現(xiàn)。本文通過介紹以造血干細胞為基礎(chǔ)的基因治療，討論了基因組編輯在臨床轉(zhuǎn)化中所遇到的困難。同時也指出基因編輯技術(shù)的進展將促進普通疾病及其以外更多疾病的應(yīng)用。

血液及免疫系統(tǒng)疾病的基因解碼

血紅蛋白病、原發(fā)性免疫缺陷（PIDs）和先天性血細胞減少癥都有一個主要的共同點：它們是由造血干細胞（HSC）內(nèi)的遺傳序列異常引起的遺傳性血液病，影響一個或多種血液細胞的產(chǎn)生和功能。[1] 原則上，這些疾病中的每一種都可以通過用基因正常的造血干細胞替換有問題的突變造血干細胞來治好，然后這些造血干細胞又可以重建一個全新的功能性血液淋巴系統(tǒng)。自1968年Good及其同事新穎成功將HSC移植到患有X連鎖嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（X-SCID）的兒童身上以來，異基因HSC移植（HSCT）已成為此類遺傳性疾病患者唯一的治療選擇[2]。然而，迄今為止，異基因造血干細胞移植的廣泛應(yīng)用受到需要合適的人類白細胞抗原（HLA）相容供體的要求的限制以及移植前需要采用細致的清髓預(yù)處理方案的限制，這可能導(dǎo)致不孕、繼發(fā)性惡性腫瘤和器官損傷[3]。移植過程中頻繁的短期和長期副作用，如免疫抑制方案引起的感染、移植物排斥反應(yīng)和移植物抗宿主病，進一步阻礙了HSCT的發(fā)展。在目前的實踐中，只有50%的患者有合適的HLA相合供體，可以進行HSCT，并且移植死亡率高達20%[4,5,6]。

由于這些限制，自體HSC基因治療的想法，即患者自身的突變HSC基因經(jīng)過基因改造，得到了發(fā)展，因為它為大量血液病提供了一種潛在的終生治療，而無需HLA匹配的供體，不會出現(xiàn)相關(guān)的免疫并發(fā)癥。此外，在自體環(huán)境中，移植前降低了強度的治療可以使血液淋巴細胞系統(tǒng)更快地重建，并有助于患者獲得列好的生存結(jié)果[7,8]。最初，自體HSC基因治療主要通過整合病毒或非病毒基因傳遞系統(tǒng)，在HSCs中通過添加致病基因的一個具有正常功能的基因拷貝來實現(xiàn)[9]。早期臨床試驗證明，病毒介導(dǎo)的有效基因轉(zhuǎn)移治療多種危及生命或孤兒血液疾病，不僅包括先天性造血障礙：鐮狀細胞?。⊿CD）和β地中海貧血[10,11,12,13]；Fanconi貧血（FA）[14]；免疫機能缺陷癥，Wiskott–Aldrich綜合征（WAS）[15,16]和X-SCID[17]；也包括代謝儲存障礙，如X-連鎖腎上腺髓白質(zhì)營養(yǎng)不良（X-ALD）[18,19]和變色性白質(zhì)營養(yǎng)不良（MLD）[20]。然而，仍然存在若干困難。首先，最有效的病毒傳遞系統(tǒng)的包裝能力限制了治療性轉(zhuǎn)基因，從而限制了通過基因添加方法可以治療的疾病。其次，對于功能獲得性有害突變，單純添加蛋白質(zhì)編碼基因不能實現(xiàn)功能矯正。第三，有效基因加入方法的一個主要缺點是治療基因整合位點不可預(yù)測，因此，插入突變、癌基因反式激活和轉(zhuǎn)基因、鄰近基因異常表達的是這一方法的內(nèi)在缺點[21,22,23,24,25]。相反，盡管進行了大量的研究工作，但通過應(yīng)用概念上更安全、非整合性載體的方法進行疾病校正仍然是短暫和低效的[26,27]。因此，綜合起來，基因添加具有固有的安全性和效率缺陷，這就使得尋找替代基因治療方法成為合情合理的事情。

可編程核酸酶技術(shù)的最新進展，包括鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)器核酸酶（TALENs）、聚集的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白（Cas）以及最近基于CRISPR/Cas的表觀遺傳學(xué)，堿基及引物編輯系統(tǒng)從策略上改變了基因治療方法。與非靶向基因添加載體相比，可編程核酸酶及其衍生物具有識別和結(jié)合特定基因組位點的能力，從設(shè)計理念上具有安全優(yōu)勢，從而能夠糾正致病突變或位點特異性破壞和整合事件，而沒有內(nèi)在的插入突變風(fēng)險[28]。對于許多遺傳性疾病來說，受影響基因的生理性和高水平表達是必不可少的，這很容易通過基因編輯工具獲得，而且它們有能力來恢復(fù)正常的基因組序列，而象基因添加方法那樣需要減少編碼或調(diào)控序列。作為一種更安全，盡管目前效率較低的非靶向基因添加的替代方法，基因編輯工具還允許在所謂的“安全港”基因座上有針對性地插入整個表達盒，或者在缺陷基因位點正確添加或替換功能性無啟動子序列，以便在內(nèi)源性控制元件下進行控制[29,30]。與非靶向插入相比，后一種方法還可以處理毒性獲得性功能突變，而與突變特異性正確修復(fù)相比，前一種方法還可以處理大的缺失或多個功能缺失突變。在過去的十年中，大量的臨床前研究為基因編輯自體造血干細胞的治療潛力提供了概念證明，最近的基因編輯治療血紅蛋白病的臨床試驗結(jié)果證明了這一點[31]。因此，更多可通過自體基因修飾的造血干細胞（見圖1）靶向的遺傳性疾病或疾病傾向可能很快進入臨床試驗及以后的開發(fā)階段。盡管正在進行的研究在解決問題的同時仍然揭示了基因編輯的許多潛在陷阱，盡管在技術(shù)領(lǐng)域和監(jiān)管軌道上仍然存在許多障礙，但在過去十年中，基因編輯技術(shù)的發(fā)展取得了驚人的進展。在此，我們簡要回顧主要基因組編輯技術(shù)（ZFN、TALENs、CRISPR/Cas9）的主要特點，并提供了當(dāng)前HSC基因編輯治療方法的最新概況，強調(diào)了主要成就和仍然存在的挑戰(zhàn)。此外，針對相應(yīng)的臨床前和臨床研究結(jié)果，我們總結(jié)了遺傳性血液病突變特異性基因組編輯領(lǐng)域的一些突破。最后，我們批判性地討論了如何解決當(dāng)前的局限性和關(guān)注點，以促進這些療法在臨床上的應(yīng)用。

通過編輯HSC可能治好的典型遺傳性疾病一覽圖。與每種疾病相關(guān)的基因在括號中標(biāo)明。給出的細胞類型表明蛋白質(zhì)表達或表型校正最明顯的地方。請注意，聯(lián)合免疫缺陷影響B(tài)細胞功能，即使在表現(xiàn)為B+表型。單核細胞和巨噬細胞（MΦ）也可能作用于造血系統(tǒng)外的細胞并用于疾病糾正（未顯示）。紅細胞（RB)，自然殺傷細胞(NK)。

造血干細胞基因編輯框架

基因編輯工具概述

早期對靶向基因編輯的嘗試依賴于將帶有同源臂的供體質(zhì)粒傳遞到靶序列，并依賴細胞同源重組機制的自發(fā)作用來促進編輯或定點整合。在開發(fā)合適的工具來增加靶位點的重組事件之前，這種方法的低效率和校正頻率不適合治療應(yīng)用。隨著雙鏈斷裂（DSBs）在受影響的位點刺激內(nèi)源性DNA修復(fù)機制的作用的發(fā)現(xiàn)，許多可編程核酸酶能夠在不同的位點誘導(dǎo)DSBs，用于基因研究和基因治療。迄今為止最流行的基于DSB的編輯平臺包括ZFN、TALENs和RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas核酸酶。核酸酶誘導(dǎo)的DNA斷裂主要通過兩種內(nèi)源性途徑修復(fù)，（i）易出錯的非同源末端連接（NHEJ）途徑，該途徑在整個細胞周期中通過連接DNA末端來糾正DSB，但偶爾會導(dǎo)致DSB位點的插入或缺失（INDEL），或者（ii）高保真同源定向修復(fù)（HDR）途徑，該途徑僅限于細胞周期的G2/S期，并且需要同源序列的存在作為修復(fù)DSB的模板[32]。通常，NHEJ被用于基因的破壞、敲除、反轉(zhuǎn)或標(biāo)記，而HDR被用于在特定基因組位點正確引入所需的序列改變（缺失、替換或插入）。

每個核酸酶平臺基于一個可定制的序列特異性DNA結(jié)合域和一個非特異性DNA切割域。對于ZNF和TALEN，DNA分別與同名的鋅指和Tal效應(yīng)器核酸酶域結(jié)合；對于CRISRP/Cas，DNA與單鏈導(dǎo)向RNA結(jié)合；對于ZFNs和TALENs，DNA由二聚體FokI核酸酶切割；對于CRISPR/Cas，DNA與由單體Cas切割。表1概述了研究最廣泛的基因編輯技術(shù)的主要特點。ZF結(jié)構(gòu)域首先在非洲爪蟾的轉(zhuǎn)錄因子IIIa而TALE結(jié)構(gòu)域首先在黃單胞菌的中發(fā)現(xiàn)，每個結(jié)構(gòu)域分別識別3個和1個堿基對。這些共價連接到FokI核酸內(nèi)切酶的識別域的模塊化串聯(lián)允許兩個ZFN或TALEN單體結(jié)合到預(yù)定切割位點任一側(cè)的對側(cè)DNA鏈上，這導(dǎo)致FokI的活性二聚體形式的靶特異性切割。另一方面，雖然ZFN和TALEN的設(shè)計比舊的編輯平臺更容易[33]，但由于需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)工程和克隆操作方案[34,35]，ZFN和TALEN的生成過程都很費勁，這使得為新靶點設(shè)計有效的核酸酶成為基因編輯領(lǐng)域的瓶頸。2012年，從抗病毒細菌免疫系統(tǒng)中衍生出RNA引導(dǎo)、序列特異性CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)，可以消除這些限制，從而改變編輯領(lǐng)域。在其工程形式中，CRISPR/Cas包含Cas9核酸內(nèi)切酶和攜帶20個核苷酸靶識別序列的單一導(dǎo)向RNA鏈（sgRNA）。它的唯局限是是額外需要一個短的（通常是3-5個核苷酸）的原始間隔序列領(lǐng)近模塊，由使用的Cas分子決定。CRISPR/Cas平臺提供了一個簡單、通用、廉價和可預(yù)測的基因編輯平臺[36,37]。該系統(tǒng)的兩個主要缺點是（i）依賴于裂解近端PAM位點，這已通過選擇或設(shè)計具有改變或放松序列要求的Cas分子來解決[29,38,39]，以及（ii）單體分子技術(shù)相對較低的靶向特異性和保真度，以及相對較高的脫靶活性，其最常見的解決方法是使用nickase-Cas分子的二聚體，通過使用或設(shè)計（高保真度）Cas分子，減少非特異性DNA相互作用，并通過更瞬時的CRISPR/Cas傳遞[40]。在臨床應(yīng)用方面，特異性增強策略隨后輔以候選核酸酶的脫靶評估，通過飽和評估潛在的脫靶位點或全基因組方法，可以為下游應(yīng)用選擇最高特異性工具。

然而，即使是對于高度特異性設(shè)計的核酸酶，對精密修復(fù)的有效性和應(yīng)用的一般安全性仍然存在更多的顧慮。最近在提高HDR的效率方面取得了重大進展，基于DSB的正確編輯即使在原始HSC[41,42,43,44,45]，臨床應(yīng)用HDR的效率也有所提高，但仍有人擔(dān)心DSB的使用，因為它可能會選擇凋亡缺陷細胞[41,46，47]或引發(fā)意外重組事件[48,49]?；贒SB的精密修復(fù)的效率考慮和對臨床應(yīng)用安全性的嚴(yán)重關(guān)注，催生了對HDR和獨立于DSB的精密編輯工具的探索。其成果是工程化學(xué)堿基編輯器的使用，當(dāng)僅有缺刻酶的Cas9融合到胞苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域時，允許有效C>T/G>堿基置換，后來變成腺苷脫氨酶，可以進行反向A>G/T>C基變化[50,51]。堿基編輯的特點是，高效，插入缺失形成最小化以及DSB誘導(dǎo)最小化，但也有可能對近端，周圍堿基的意外修飾，以及無法創(chuàng)建正確的缺失插入突變或者是嘌呤到嘧啶、嘧啶到嘌呤的顛換。在克服這些缺點的另一個里程碑式努力中，將僅有nickase的Cas9與逆轉(zhuǎn)錄酶域和多功能的引物基本編輯導(dǎo)向RNA（PEGNA）結(jié)合起來，后者進行目標(biāo)識別，同時作為反向轉(zhuǎn)錄的引物和模板。雖然目前的效率不如堿基編輯，但所產(chǎn)生的引物編輯技術(shù)比化學(xué)修改更為通用更為正確。不僅可以進行所有 的12個可能的堿基對堿基的轉(zhuǎn)換之外，還允許創(chuàng)建小的正確的插入缺失突變[52]。除了堿基和引物編輯工具外，還通過將催化活性不活躍的核酸酶如死亡Cas9（dCas9）模塊化融合，建立了一系列表觀基因組編輯器，這些酶域包括表觀遺傳修飾物，如甲基酶或轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)。多種表觀遺傳修飾的組合甚至可以實現(xiàn)幾乎有效的可逆轉(zhuǎn)錄變化，可以在經(jīng)歷數(shù)百個有絲分裂而保持穩(wěn)定[53,54]。

迄今為止，基于DSB和不依賴DSB的編輯技術(shù)都已被證明能夠糾正包括HSC在內(nèi)的許多細胞類型的致病基因突變，目前需要克服平臺在安全性和有效性方面的特定不足。

2.2. HSC編輯臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素

以造血干細胞為編輯底物，可編程核酸酶的主要類別已被用作治療遺傳性血液病的治療工具（圖2）。所采用的策略依據(jù)所針對的疾病和所選擇的遞關(guān)方式可大致分為體外或體內(nèi)基因編輯方法。

通用基因編輯平臺的結(jié)構(gòu)、功能及基于HSC的應(yīng)用。ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9是嵌合蛋白質(zhì)，其包含可定制的序列特異性DNA結(jié)合域（例如，鋅指ZF、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)蛋白TALEs或單導(dǎo)向RNA sgRNA）和介導(dǎo)DNA切割的非特異性核酸酶（例如：在ZFNs和TALENs中的FokI核酸酶和在CRISPR/Cas9中的Cas9）。ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂主要通過兩種內(nèi)源性途徑修復(fù)：（1）易出錯的非同源末端連接（NHEJ），它發(fā)生在整個細胞周期中，通過連接DNA末端來糾正斷裂；（2）通過正確的同源定向修復(fù)（HDR），在提供的供體模板存在下，例如，作為合成單鏈寡脫氧核糖核苷酸（ssODNs）、插入失活慢病毒載體（IDLV）或腺相關(guān)病毒6載體（AAV6）組分。堿基編輯器是由突變的核酸酶組成的嵌合蛋白質(zhì)，如Cas9-nickase（nCas9），一個催化結(jié)構(gòu)域，能夠使胞苷或腺嘌呤堿基脫氨以誘導(dǎo)堿基置換，和一個尿嘧啶糖苷酶抑制劑以防止堿基置換過程中的堿基切除修復(fù)。引物編輯器是一種嵌合蛋白，利用擴展的gRNA，稱為引物編輯導(dǎo)向RNA（pegRNA）和融合到逆轉(zhuǎn)錄酶的nCas9，后者切割DNA，使側(cè)翼gRNA的pegRNA結(jié)合成為所需序列變化的pegRNA定向逆轉(zhuǎn)錄的引物。

歷史上，影響造血細胞系的遺傳性血液疾病，如血紅蛋白病、PIDs和儲存障礙，已通過體外處理HSC得到解決。而影響細胞外血蛋白的遺傳性血液疾病，如凝血因子缺乏癥和血友病，通過向肝細胞進行體內(nèi)體內(nèi)交付來解決。直到最近，我們還看到了以HSC為基礎(chǔ)的體內(nèi)基因治療遺傳性血液病的努力，以減少治療相關(guān)的風(fēng)險和死亡。圖3展示了體內(nèi)和體外HSC基因編輯的關(guān)鍵步驟。在分離和操作HSCs方面取得的進展與成熟的HSCT方案相結(jié)合，有利于HSCs的體外修飾，這種修飾已經(jīng)在臨床上應(yīng)用于多種遺傳疾病。盡管有這些令人興奮的進展，但為了使基于基因編輯的自體造血干細胞的治療充分發(fā)揮其潛力，仍然存在需要解決的主要障礙。相關(guān)因素包括：（i）來源：長期再生HSC的來源和選擇；（ii）培養(yǎng)：為擴增和編輯提供環(huán)境，同時保持HSC的‘干性’和高植入潛力，（iii）遞送：將編輯成分應(yīng)用于體外或體內(nèi)靶細胞/組織，以及（iv）案全性：避免、識別和消除重組事件和非靶細胞進入和編輯事件，以及預(yù)防其他治療相關(guān)的并發(fā)癥。
圖3：

體外與體內(nèi)HSC基因編輯。所示的體外編輯步驟廣泛應(yīng)用于體內(nèi)動物模型的基因編輯，現(xiàn)在也應(yīng)用于基因編輯的臨床試驗?；蛱砑盈煼ǖ难芯拷Y(jié)果表明，基因編輯也可能受益于通過提供抗體-藥物結(jié)合物來選擇性去除HSC[55]，對于適當(dāng)?shù)募膊?，如FA，也可能受益于無預(yù)處理植入校正細胞[14]。顯示的體內(nèi)編輯步驟部分是針對HSC靶向基因添加方法的外推[56,57,58]，部分是基于基因編輯成分和mRNAs傳遞的最新進展和理念[59,60,61,62]。

2.2.1. HSC的來源和分離

造血干細胞占成人骨髓細胞的比例不到0.1%，是一種罕見而脆弱的細胞群，通常存在于與細胞外基質(zhì)、成骨細胞和基質(zhì)細胞相連的特殊微環(huán)境中，這些微環(huán)境在很大程度上決定了它們的靜息狀態(tài)、自我更新或分化行為。HSC可以通過全身麻醉或局部麻醉下的多次骨髓穿刺來收集，或者在HSC從骨髓基質(zhì)強制分離（動員）到外周血后通過白細胞清除來實現(xiàn)。目前，經(jīng)過FDA批準(zhǔn)的臨床上可以使用的動員劑有三種：造血生長因子、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）以及小型藥物趨化因子類似物普列沙福。一系列評估不同動員劑在基于HSC的基因治療中的安全性和有效性的臨床試驗表明，G-CSF和普列沙福的聯(lián)合應(yīng)用可以增強HSC的動員和持續(xù)的體內(nèi)再增殖潛能[63,64,65,66]?；蛘撸瑢τ谏贁?shù)（5–10%）對一線方案反應(yīng)不佳的病例（5–10%），療效較差的GM-CSF可用作補救策略[67]。值得注意的是，收集用于臨床應(yīng)用的造血干細胞的一個主要問題是某些疾病（如FA和其他骨髓衰竭綜合征）可獲得的細胞數(shù)量，其中造血干細胞的數(shù)量/質(zhì)量以及骨髓的成分顯著受損。為此，誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）技術(shù)的發(fā)展[68]提供了另外一種患者來源細胞，許多研究小組將其作為基因靶向的可再生細胞來源加以利用。IPSC在生成HSC的潛在應(yīng)用在此不再贅述，但圍繞這一概念的廣泛希望和關(guān)注最近已在其他地方進行了詳細論述[69]。

以表面標(biāo)記CD34、CD133、CD90、CD38、CD45RA為基礎(chǔ)的原始、長期再生造血干細胞（LTR-HSC）的免疫表型特征已取得進展，因此在人類和非人靈長類動物中，它們的定義不同，例如CD34+CD38−, CD34+CD90+、CD34+CD90+CD133+或CD34+CD90+CD45RA− 細胞[41,42,43,44,45,70,71]。然而，由于CD34+細胞在治療性HSC移植中的長期成功經(jīng)驗，祖細胞在移植后早期骨髓重建中的支持作用，具有高度特異性選擇方案的LTR-hsc的總產(chǎn)量顯著降低，臨床方案很大程度上依賴于CD34+的單標(biāo)記免疫磁性選擇[45,72]。唉，CD34+細胞群本身在很大程度上是異質(zhì)性的，只有一小部分細胞（1–3%）代表LTR HSC[16,73,74]，它們似乎位于CD34+CD38−細胞群中。CD34+CD380–6%的人群幾乎代表了所有短期和LTR-HSC潛能的總和[75]。然而，CD34-細胞對LTR-HSC池也有重要貢獻[76]。因此，對于所有LTR-hsc的明確的陽性/陰性選擇方案，如全面大規(guī)模細胞分離所需，仍然是難以捉摸的，但具有關(guān)鍵的實際意義。高嵌合體和移植后快速重建依賴于高細胞產(chǎn)量，而特別是對于HSC的基因治療應(yīng)用，利用更純的細胞群將有助于降低成本并使治療更為廣泛，因為載體需求與暴露于載體的細胞數(shù)量大致成比例。在這種情況下，許多臨床試驗證明了CD34+CD90+細胞的成功移植[70,71]，而一些研究表明，對于慢病毒基因的添加，分選高純度的CD34+CD38− 或者CD34+CD90+HSC可以減少培養(yǎng)體積，減少載體需求，顯著提高轉(zhuǎn)化效率[75,77,78]。在臨床應(yīng)用方面，開發(fā)基于免疫磁珠富集的良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）分級平臺，允許CD34+CD38-的富集和細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，而在轉(zhuǎn)導(dǎo)后加入祖細胞CD34+CD38+細胞可以加速髓系重建[75]。優(yōu)化和采用這一或其他LTR-HSC選擇性系統(tǒng)以獲得特異而全面的LTR-HSC，降低載體成本，減少處理和培養(yǎng)時間，將極大地促進基于HSC的基因編輯的臨床應(yīng)用。

2.2.2. 真LTR-HSCs的體外擴增與編輯

HSCs的有效遺傳修飾需要HSCs的體外培養(yǎng)和擴增。然而，從天然支持性微環(huán)境中移除對脆弱的造血干細胞有負面影響。此外，在收集和免疫磁性富集后，來自骨髓或動員的外周血的大多數(shù)CD34+細胞處于靜止?fàn)顟B(tài)（細胞周期的G0/G1期）。這對依賴于修飾后細胞的擴增或依賴于細胞周期的基因編輯策略提出了造成了的挑戰(zhàn)，例如HDR是與依賴與NHE相反的S/G2限制性的策略[79]。CD34+HSC的預(yù)激活促進了細胞退出靜止?fàn)顟B(tài)以便進行有效的基因修飾，而增加的刺激也與誘導(dǎo)分化和HSC長期植入能力的損傷有關(guān)[77,80]，這將對臨床應(yīng)用產(chǎn)生可怕的后果。通過在免疫缺陷小鼠中植入修飾細胞的兩項示范性研究證明了這種植入和長期再植入能力的降低，特別是基于HDR的修復(fù)，在小鼠骨髓中人類細胞的長期（16周）修飾率與移植細胞中的初始修飾率進行比較，NHEJ介導(dǎo)的編輯（55%?46%, 19.8%?3.3%比HDR介導(dǎo)的編輯（11.8%?2.3%, 17.3%?0.9%)更接近 [81,82]. 目前，基于無血清培養(yǎng)基（通常補充有重組造血生長因子和細胞因子，如干細胞因子、FMS樣酪氨酸激酶3配體、血小板生成素、白細胞介素-3和白細胞介素-6）優(yōu)化的HSC體外培養(yǎng)和刺激條件，使造血干細胞增殖旺盛，但也逐漸分化。為了克服這一局限性，已投入大量精力建立新的培養(yǎng)和輸送方案，以提高HDR率，促進HSC的體外擴增，同時保留其“干細胞”特性，如文獻所述，最近通過抑制p53結(jié)合蛋白1增加了這一點[60,83，84,85]. 在過去幾年中，已經(jīng)研究了通過同步S/G2期細胞、通過誘導(dǎo)HDR成分或通過藥理或遺傳抑制NHEJ成分來改善HDR介導(dǎo)的基因編輯的策略[85,86,87,88,89]，包括不同類型HDR供體的適用性（見下文第2.2.3節(jié)）。同時，高通量篩選研究發(fā)現(xiàn)了一些小分子，如前列腺素E2（PGE2）、莖葉皂甙元1（SR1）和嘧啶吲哚衍生物UM171，它們能夠提高HSC的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，促進HSC在體外的擴增[77,90,91,92]。然而，這些化合物對造血干細胞長期再生能力和多向分化潛能的影響仍有待進一步研究。
 

2.2.3. 遞送——到達目標(biāo)細胞和部位

基因編輯工具（包括編輯器和任何外源性同源供體修復(fù)模板）高效、無毒地導(dǎo)入HSC是基因編輯HSC臨床應(yīng)用的長期挑戰(zhàn)之一。

盡管編輯器可以以多種不同的形式進行遞送，但基于HDR的方法HSC基因編輯依賴于供體DNA修復(fù)模板在編輯過程中的共同傳遞和存在，如通?；瘜W(xué)修飾的ssODN、單鏈DNA（ssDNA）病毒基因組，或者用于長靶向插入的雙鏈DNA分子。不同的供體利用不同的修復(fù)途徑，具有不同的毒性水平和編輯精度，由于原始HSC對該操作過程的頑固性和敏感性，優(yōu)化修復(fù)途徑尤其對臨床應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)[42,93,94]。

多年來，開發(fā)了多種非病毒和非整合的病毒傳遞系統(tǒng)，用于體內(nèi)或體外核酸酶的傳遞，包括質(zhì)粒DNA、體外轉(zhuǎn)錄RNA、TALEN/ZFN蛋白或CRISPR/Cas核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）等非病毒載體，整合酶缺陷型LV（IDLV）、腺病毒（AdV）和腺病毒相關(guān)病毒（AAV）作為病毒載體。每種系統(tǒng)都有各自的優(yōu)缺點。利用攜帶核酸酶和供體模板的質(zhì)粒DNA進行電穿孔是編輯HSCs最廉價、應(yīng)用最廣泛的方法。然而，HSC的毒性、質(zhì)粒細菌DNA的骨架以及由于核酸酶表達盒可能隨機整合到宿主基因組中而導(dǎo)致的遺傳毒性的固有風(fēng)險的擔(dān)憂，使其僅限于用于原理性研究[95,96]?？紤]到基因編輯系統(tǒng)在靶細胞內(nèi)的持續(xù)時間和濃度是決定靶向和非靶向DNA切割的關(guān)鍵因素，通常主要目標(biāo)是采用“命中-逃逸”方法，包括在靶細胞內(nèi)瞬間高表達核酸酶。為此，體外轉(zhuǎn)錄的mRNA或編碼核酸酶的gRNA/mRNA和供體模板的核轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染已成為HSC基因編輯的先進遞送形式，多項研究表明，此方法具有高轉(zhuǎn)染效率和最低細胞毒性[97,98,99]。體外轉(zhuǎn)錄mRNA的瞬時和強大的細胞質(zhì)內(nèi)表達將潛在的非靶向插入或突變風(fēng)險降至最低，同時一些研究進一步研究了（下調(diào)）正確編輯的編輯時間窗口的方法[100,101,102]。相反，對于某些應(yīng)用，mRNA的短半衰期可能是一個限制因素[103]。因此，一些研究小組致力于修改體外轉(zhuǎn)錄的mRNA的結(jié)構(gòu)元件，特別是通過加入抗逆轉(zhuǎn)帽類似物、聚（a）尾和含有調(diào)控元件的5′和3′UTRs來增強細胞內(nèi)穩(wěn)定性和翻譯效率[104]。最近，Wesselhoeft及其同事報告說，環(huán)狀RNA提高了RNA的穩(wěn)定性，并與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量和穩(wěn)定性的提高有關(guān)[105]。就像體外轉(zhuǎn)錄的TALEN和ZFN的mRNA或CRISPR/Cas的mRNA/gRNA一樣，預(yù)組裝的CRISPR/Cas核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物是HSC基因編輯的高效載體，允許在體外更可控和瞬時地傳遞核酸酶活性[106107108]。因此RNP電穿孔發(fā)展成為HSC體外修飾的一種選擇方法時，HSC的體內(nèi)遞送作為一個新興的關(guān)注領(lǐng)域在使用純化的核酸酶時提出了一些技術(shù)挑戰(zhàn)。Cas9蛋白的大尺寸和正電荷阻礙了其在體內(nèi)的細胞內(nèi)傳遞，而Cas9蛋白在體內(nèi)的暴露又可能引起細胞和體液免疫反應(yīng)。事實上，鑒于CRISPR/Cas的微生物來源，在79%和65%的人類血清中分別檢測到來自金黃色葡萄球菌（SaCas9）和化膿性鏈球菌（SpCas9）的Cas9抗體并不奇怪[109]，這對編輯效率的影響需要降低到最低。為此，減少核酸酶降解和宿主潛在免疫反應(yīng)的脂質(zhì)或金納米顆粒已被用于體內(nèi)基因編輯，盡管在造血干細胞中實現(xiàn)的基因編輯率不足以治療大多數(shù)造血疾病[110111]。此外，許多非整合病毒載體，如IDLVs和AAVs等，對hsc具有高度的趨化性，已被用于基因編輯成分的傳遞。非整合型AAV病毒載體（尤其是rAAV6）由于其在非分裂細胞（如HSCs）中的高轉(zhuǎn)導(dǎo)率和非致病性行為而成為一種很有前途的核酸酶傳遞系統(tǒng)，使其成為體內(nèi)和潛在治療應(yīng)用的理想載體。然而，它有限的包裝容量低于4.8kb，這使得它不適合像TALENs和許多Cas9變體這樣的大型核酸酶。為了解決這一局限性，Bak等人最近開發(fā)了一種雙AAV6供體載體系統(tǒng)（具有6.5 kb的包裝容量），該系統(tǒng)能夠有效地靶向T細胞和造血干細胞而毒性很低[112113]。IDLVs甚至整合LVs，由于其大于10kb的載量，已被廣泛用于核酸酶和供體DNA模板的傳遞，用于篩選文庫等研究性應(yīng)用，IDLVs也被提出用于臨床應(yīng)用。然而，AAV-和IDLV-衍生的單鏈DNA在靶組織中保留很長時間[114115]，因此存在持續(xù)基因組修飾和外源DNA錯誤整合的風(fēng)險。

2.2.4. 安全性：避免靶細胞和部位失去目標(biāo)及臨床實驗中的其他未知因素

基因編輯產(chǎn)品的質(zhì)量可以受到上述三個因素中的任何一個，即來源、培養(yǎng)和交付的次優(yōu)選擇的限制。需要進行大規(guī)模的臨床前研究，以確定確保每種疾病的基因編輯產(chǎn)品的治療效益所需的長期安全性、持續(xù)性和最佳校正水平，同時將細胞毒性和潛在的靶外活性保持在最低水平。

與傳統(tǒng)的基因治療方法相比，基因編輯平臺消除了病毒載體近隨機整合的需要，從而最小化插入性遺傳毒性的風(fēng)險。然而，監(jiān)測可編程核酸酶的活性和特異性仍然是一個挑戰(zhàn)。基因編輯的HSC治療潛力最大的擔(dān)心之一是在與預(yù)定目標(biāo)具有實質(zhì)序列相似性的位點引入不需要的非目標(biāo)基因組修飾[48]?；贒SB甚至HDR介導(dǎo)的基因編輯固有的另一個擔(dān)心是，由于意外地使用替代修復(fù)途徑（例如基于NHEJ的修復(fù)）而引入在靶標(biāo)上進行的插入缺失或重組事件，這可能導(dǎo)致潛在的插入缺失，或者在某些情況下可能引發(fā)潛在的致癌易位突變。已觀察到四種主要可編程核酸酶中的每一種都存在非目標(biāo)活性[116171118119]。為了評估和幫助最小化目標(biāo)外活動和相關(guān)風(fēng)險，開發(fā)了越來越多的分析方法，以確定目標(biāo)外事件的分布和頻率，包括基于序列同源性和計算算法的硅工具方法、離體方法（CIRCLE-Seq，Digenome-seq和SITE-seq）和基于細胞的分析方法（GUIDE-seq、BLESS/Blis和HTGTS）[120]。GUIDE-seq和Digenome-seq被認為是迄今為止最敏感的全基因組方法；然而，沒有一種方法被證明適合于臨床試驗[121]。染色體重排評估方法目前才出現(xiàn)[48,49]，CAST-Seq甚至允許定量評估，盡管僅限于預(yù)測的on-to-off靶位點之間的重組事件[122]。 

堿基和引物編輯作為不依賴于DSB的編輯策略有助于降低甚至消除DSB介導(dǎo)的遺傳毒性事件的內(nèi)在風(fēng)險。此外，減少編輯分子脫靶活性的策略有助于減少因疏忽而產(chǎn)生的插入缺失和重組事件，這也適用于DSB依賴的編輯。發(fā)表了大量限制脫靶的策略，除了對編輯工具的有限接觸外，還包括但不限于在ZFN和TALEN中使用專性異二聚體FokI，使用nickase-Cas9二聚體分子，建立更嚴(yán)格的PAM序列，高保真Cas版本中非特異性DNA相互作用的去除，CRISPR/Cas sgRNAs的截斷、延伸或泡狀發(fā)夾修飾[40，123，124]

盡管有大量的研究小組正在致力于上述四個領(lǐng)域的進一步技術(shù)開發(fā)，但HSC編輯的臨床前和臨床應(yīng)用進展迅速。這尤其得益于臨床前和臨床試驗的經(jīng)驗，這些經(jīng)驗來自于有關(guān)HSC來源和培養(yǎng)的基因添加方法，部分基于有效的體外RNP傳遞，結(jié)合飽和脫靶分析，以應(yīng)對編輯最緊迫的安全問題。

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