【佳學(xué)基因檢測(cè)】狐臭基因檢測(cè)、腋臭基因檢測(cè)技術(shù)介紹

狐臭、腋臭基因檢測(cè)導(dǎo)讀

個(gè)性化醫(yī)療和醫(yī)療保健的重要性日益受到重視。最近，人們已經(jīng)對(duì)與各種人類遺傳疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)以及藥物引起的不良反應(yīng)相關(guān)的基因多態(tài)性進(jìn)行了深入研究，功能基因組學(xué)和全基因組關(guān)聯(lián)研究正在揭示其潛在的分子機(jī)制。了解某些基因多態(tài)性對(duì)于狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)了解個(gè)體間藥物反應(yīng)和/或疾病風(fēng)險(xiǎn)的差異具有臨床重要意義。隨著此類證據(jù)的積累，需要新的臨床應(yīng)用和實(shí)踐。在這種情況下，開發(fā)簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)高效的基因分型新技術(shù)勢(shì)在必行。在這里，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)描述了一種簡(jiǎn)單的等溫基因分型方法，該方法能夠檢測(cè)人類 ATP 結(jié)合盒 (ABC) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ABCC11 基因中的單核苷酸多態(tài)性 (SNP) ，以及它在腋窩異味臨床診斷中的應(yīng)用。狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)最近報(bào)道，腋窩異味與ABCC11基因中的一個(gè) SNP 538G>A 有關(guān)。狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)的分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究表明，該 SNP 極大地影響了 ABCC11 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平和功能。在《狐臭基因檢測(cè)、腋臭基因檢測(cè)技術(shù)介紹》，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)強(qiáng)調(diào)了這種診斷策略在腋臭治療中的臨床相關(guān)性和重要性。

基于基因型診斷的新方法

ABCC11 538G>A 基因快速分型評(píng)估腋臭風(fēng)險(xiǎn)

ABCC11基因型 (538G>A) 與腋窩異味之間的關(guān)聯(lián)使狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)能夠?qū)σ父C異味進(jìn)行基于基因分型的診斷，這被認(rèn)為比基于表型的診斷更為客觀和準(zhǔn)確。因此，在臨床環(huán)境中，需要快速、簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)有效的按需基因分型方法。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)最近開發(fā)了一種基于等溫 DNA擴(kuò)增技術(shù)的針對(duì)人類ABCC11基因中的 S??NP 538G>A 的簡(jiǎn)單方法 （圖1(a)–1(c)）新方法可以在等溫反應(yīng)條件下 30 分鐘內(nèi)確定基因型，而無(wú)需分離基因組 DNA 和隨后的 PCR 步驟。

圖1：使用 SmartAmp 方法對(duì) ABCC11 538G>A 進(jìn)行基因分型。 (a) 基于 SmartAmp 的基因分型流程圖。經(jīng)過簡(jiǎn)單的熱處理以降解 RNA 和變性蛋白質(zhì)后，將血液樣本添加到反應(yīng)混合物中（總共 25 μ L），并在 60°C 下進(jìn)行恒溫孵育 30 分鐘，同時(shí)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。(b)使用 SmartAmp 方法檢測(cè)ABCC11中的 SNP 538G>A。通過實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng) (Mx3000P; Stratagene) 監(jiān)測(cè)攜帶 538G (WT) 或 538A (SNP) 等位基因的ABCC11等位基因特異性引物與 SmartAmp 反應(yīng)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間增加。(c) 基于 SmartAmp 的基因分型的人類ABCC11基因示意圖和每個(gè)引物的相對(duì)位置。 （d）使用 CCD 攝像頭連接的數(shù)字處理器對(duì)基于 SmartAmp 的 SNP 分型進(jìn)行多端點(diǎn)檢測(cè)的示意圖。

2.2. 基因分型程序

在狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的方法中，整個(gè)DNA擴(kuò)增過程是通過設(shè)計(jì)總共5個(gè)引物來(lái)實(shí)現(xiàn)的，即回程引物（TP）、正向引物（FP）、增強(qiáng)引物（BP）以及外引物1和2（OP1和OP2）（表格1).另外，為了抑制錯(cuò)配序列對(duì)的背景擴(kuò)增，構(gòu)建了競(jìng)爭(zhēng)性探針（CP），對(duì)ABCC11基因中的SNP 538G>A進(jìn)行有效的基因分型。

表1：用于檢測(cè)人類ABCC11基因中的 WT 和 SNP 等位基因的引物組

TP：折返引物；FP：正向引物；BP：加強(qiáng)引物；OP：外引物；CP：競(jìng)爭(zhēng)探針。

由于該方法只需要少量（1-2  μ L）外周血，因此基因分型很容易。每個(gè) SNP 分型反應(yīng)在 60°C 等溫條件下在 25 μ L 反應(yīng)混合物中進(jìn)行 。混合物含有 2.0  μ M FP、2.0  μ M TP、1.0  μ M BP、各 0.25  μ M OP、20  μ M CP、1.4 mM dNTP、5% DMSO、20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM KCl、10 mM (NH 4 ) 2 SO 4、8 mM MgSO 4、0.1% (v/v) Tween®20、1/100,000 稀釋 SYBR® Green I（Takara Bio Inc.，日本滋賀縣）和 0.24 U/ μ L Aac DNA 聚合酶（KK DNAFORM，日本橫濱市）。多態(tài)性 538G>A 以 TP 為特征。等位基因特異性 TP 和 FP 可誘導(dǎo) DNA 擴(kuò)增和隨后的自我引發(fā)延伸（產(chǎn)生更大的 DNA）。

通過引入 CCD 相機(jī)和計(jì)算數(shù)據(jù)采集，可以實(shí)現(xiàn)對(duì) SNP 依賴性 DNA 擴(kuò)增信號(hào)的多終點(diǎn)測(cè)定，即 SYBR Green I 的熒光增加，從而實(shí)現(xiàn)更簡(jiǎn)單、更具成本效益的檢測(cè)（圖 1（d））。

2.3. 基于 SmartAmp 方法的 DNA 擴(kuò)增過程

在基于恒溫 SmartAmp 的 DNA 擴(kuò)增的第一步中，F(xiàn)P 和 TP 與模板基因組 DNA 雜交。接下來(lái)，由各引物引發(fā)的擴(kuò)增產(chǎn)物從模板基因組 DNA 上分離。該過程由鏈置換 DNA 聚合酶誘導(dǎo)，其延伸分別由 OP1 和 OP2 引發(fā)。隨后，單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物成為第二步擴(kuò)增中相反的 FP 和 TP 的新模板。由于 FP 和 TP 的特殊性質(zhì)，這些擴(kuò)增子將在其 3′ 和 5′ 端重新折疊以形成新的引發(fā)位點(diǎn)，從而在進(jìn)一步的自我引發(fā)的 DNA 延伸中維持自我擴(kuò)增。狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)在之前的報(bào)告中以示意圖形式說明了 SmartAmp 反應(yīng)中串聯(lián) DNA 產(chǎn)物的形成。

CP 可抑制錯(cuò)配序列對(duì)的背景擴(kuò)增。例如，用于檢測(cè) WT (538G) 等位基因的 CP 被設(shè)計(jì)為替代 (538A) 等位基因周圍的互補(bǔ)序列，并且其 3′ 端通過胺化進(jìn)行修飾（圖 1（a）)。因此，該 CP (538G) 抑制了 WT 等位基因的 FP 錯(cuò)退火以及隨后的基于 SmartAmp 的來(lái)自攜帶 SNP (538A) 等位基因的基因組 DNA 的擴(kuò)增。CP (538A) 以類似的方式增強(qiáng)了等位基因特異性擴(kuò)增的檢測(cè)特異性。

2.4. 腋臭的臨床決策和治療

ABCC11基因的 SNP 基因檢測(cè)是醫(yī)生做出決定的臨床因素之一。攜帶 538G/G 或 538G/A 基因型的患者可以接受切除頂泌腺的手術(shù)，而攜帶 538A/A 基因型的患者則不適合進(jìn)行此類手術(shù)（圖 2）。

圖 2：針對(duì)腋窩異味的診斷和治療的基因靶向策略。該策略將有助于腋窩異味的客觀診斷，尤其是對(duì)于有主觀嗅覺錯(cuò)覺的 ORS 患者。

流行病學(xué)調(diào)查顯示，與 538GG/GA 基因型不同， ABCC11 538A/A 基因型的受試者患腋臭的風(fēng)險(xiǎn)很小。據(jù)《人體體味產(chǎn)生的多樣化原因及基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性》，該 SNP 與除臭劑的使用相關(guān)，而 538A/A 基因型的受試者不受腋臭的直接影響。特別是，對(duì)于患有嗅覺參考綜合征 (ORS) 的患者，他們往往僅僅因?yàn)閷?duì)體味的錯(cuò)覺而選擇積極的手術(shù)治療，遺傳證據(jù)將是診斷和非手術(shù)治療的有力工具。因此，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)提出了如圖所示的臨床決策樹圖 2。

2.5. 嗅覺參考綜合征與腋臭的鑒別

基于基因型的診斷對(duì)于嗅覺參照綜合征 (ORS) 患者尤其有用。許多 ORS 患者（在日本醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中也稱為“jiko-syu-kyofu”）的特點(diǎn)是始終認(rèn)為自己的身體會(huì)散發(fā)出強(qiáng)烈和/或令他人反感的難聞體味。這些患者堅(jiān)信自己就是強(qiáng)烈氣味的來(lái)源，即使周圍的人否認(rèn)。這種嗅覺錯(cuò)覺是 ORS 的主要特征，醫(yī)生有時(shí)會(huì)在診斷腋窩臭味時(shí)識(shí)別出這種癥狀。ORS 患者傾向于希望手術(shù)切除腋窩頂泌腺能從根本上解決他們的問題，即使這與醫(yī)生的臨床判斷相反。由于醫(yī)生對(duì)這種產(chǎn)生氣味的疾病的主觀診斷對(duì)這些患者來(lái)說在心理上難以接受，因此，表明他們沒有風(fēng)險(xiǎn)的客觀證據(jù)對(duì)于勸阻他們不進(jìn)行手術(shù)非常重要。此外，如果盡管進(jìn)行了手術(shù)，但體臭的困擾仍未得到緩解，導(dǎo)致這些患者對(duì)自己的體臭更加緊張，那就太不幸了。因此，即使患者或家屬對(duì)此感到焦慮，也應(yīng)避免僅根據(jù)他們的要求進(jìn)行不必要的手術(shù)。因此，對(duì)ABCC11 SNP 538G>A 進(jìn)行基因分型可以以客觀的方式提供科學(xué)證據(jù)，作為臨床醫(yī)生主觀/經(jīng)驗(yàn)評(píng)估的替代方法。

進(jìn)一步了解ABCC11 538G>A

《體味的發(fā)病原因基因解碼》在人類ABCC11基因中發(fā)現(xiàn)了 10 多個(gè)非同義 SNP ，但只有 538G>A (Gly180Arg) 與上述表型直接相關(guān)。SNP 538G>A 位于外顯子 4 中，其中 Gly180 被 Arg180 取代，位于 ABCC11 蛋白的第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域中。這種氨基酸取代導(dǎo)致新生 ABCC11 蛋白的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。SNP 變體 ABCC11 Arg180 經(jīng)歷蛋白酶體降解并失去其細(xì)胞內(nèi)功能（圖 3）。這種分子機(jī)制與人類耳垢和腋窩臭味等頂泌腺相關(guān)表型屬于孟德爾性狀的事實(shí)相一致。事實(shí)上，人類頂泌腺的熒光免疫組織化學(xué)分析表明，ABCC11 Gly180（野生型：WT）在腺體中表達(dá)，而非同義 SNP 538G>A 極大地影響了 ABCC11 蛋白在頂泌分泌細(xì)胞中的細(xì)胞定位。

圖 3：SNP 基因型 (Arg180) 對(duì) ABCC11 蛋白質(zhì)水平和細(xì)胞內(nèi)降解的影響。 (a) 為了評(píng)估 Arg180 變體對(duì) ABCC11 蛋白質(zhì)水平的影響，在蛋白酶體抑制劑 MG132 存在下培養(yǎng)表達(dá) ABCC11 WT 或 Arg180 變體的 Flp-In-293 細(xì)胞 24 小時(shí)。用糖苷酶 PNGase F 處理后，通過用 ABCC11 特異性抗體進(jìn)行免疫印跡分析 ABCC11 WT 和 Arg180 變體蛋白。將信號(hào)強(qiáng)度比 (ABCC11/GAPDH，內(nèi)部控制) 標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照并表示為平均值±SD。 (b) ABCC11 WT 的翻譯后修飾和 Arg180 變體的蛋白酶體降解的示意圖。

盡管決定顯性表型的 ABCC11 內(nèi)源性底物尚未闡明，但最近的研究結(jié)果表明 ABCC11 WT 有助于人類頂泌腺的發(fā)育和/或分泌活性的調(diào)節(jié)。例如，在手術(shù)切除過程中，通常在腋窩腋臭患者的腋窩中觀察到大而廣泛的頂泌腺。濕型耳垢來(lái)自外耳道頂泌腺的分泌產(chǎn)物，而干型表型中缺乏這種頂泌腺分泌物。此外，根據(jù)狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)耵聹頂泌腺組織切片的初步分析，538G/A 受試者的頂泌腺管腔面積大于 538A/A 受試者的頂泌腺管腔面積（圖 4）頂泌腺的總分泌活性取決于組織發(fā)育和調(diào)節(jié)頂泌腺分泌的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，因此，ABCC11 WT 應(yīng)參與人的頂泌腺的發(fā)育，導(dǎo)致頂泌汗液的過量產(chǎn)生，包括腋臭的前體化合物。新近，基因解碼證明，ABCC11 538A/A 基因型不會(huì)導(dǎo)致前體的完全缺失，并且與 538G/G 或 G/A 基因型相比，產(chǎn)生的前體化合物水平明顯較低。這些發(fā)現(xiàn)表明， ABCC11 538A/A 基因型的頂泌腺幾乎沒有分泌活性。他們推測(cè)，他們的結(jié)果是由于 Arg180 變體中 ABCC11 活性水平極低造成的。然而，對(duì)這種極小分泌的更合理解釋可能是，除了 ABCC11 之外，調(diào)節(jié)頂泌腺總分泌活性的其他因素也有助于促進(jìn)頂泌腺的分泌。要闡明這一點(diǎn)，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步解決 ABCC11 蛋白如何參與頂泌腺的調(diào)節(jié)的問題。

圖 4：ABCC11 538GA 和 538AA 的人類頂泌腺圖像分析。（a）外耳道中人類頂泌腺的典型圖像（左）。圖像分析測(cè)量參數(shù)示意圖（右）。（b 和 c）ABCC11 538GA 受試者的頂泌腺發(fā)育良好（灰色），而 538AA 受試者的頂泌腺發(fā)育良好（白色）。使用 ImageJ 程序 (v1.46d) 分析了人類頂泌腺 的組織學(xué)圖像。計(jì)算數(shù)據(jù)以箱線圖表示。當(dāng)p < 0.01 ( ∗ )時(shí)，差異被認(rèn)為是顯著的。

有趣的是，如圖圖 5所示例如，人類ABCC11基因中 SNP 538G>A 的等位基因頻率在不同種族群體之間存在很大差異，反映了智人洲際遷徙歷史上人類基因組的遺傳多樣性。根據(jù)流行的“走出非洲”理論，古人類應(yīng)該攜帶ABCC11 538G 等位基因，對(duì)應(yīng)頂泌腺的高分泌表型?？紤]到人類腋窩中類信息素化合物的產(chǎn)生可能源自腋窩頂泌腺，受 ABCC11 直接或間接調(diào)控的腋窩氣味可能對(duì)古人和狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)的祖先之間的非語(yǔ)言交流非常重要。

圖 5：不同種族人群中ABCC11 538G (WT; Gly180) 和 538A (Arg180)的等位基因頻率

體臭、狐臭和腋臭到底是什么？是否可以進(jìn)行基因檢測(cè)？

腋臭的特點(diǎn)

人類往往會(huì)散發(fā)出奇特的體味，但每個(gè)人的體味可能都是長(zhǎng)期存在的，也可能是微不足道的。在大多數(shù)文化中，體味常常被他人視為令人不快的事情，同時(shí)也會(huì)影響散發(fā)體味者的自信和自尊。為了解決這個(gè)問題，人類已經(jīng)開發(fā)出各種方法來(lái)管理體味，例如使用除臭劑、清爽噴霧和香水。在現(xiàn)代社會(huì)中，消除體味是日常打扮的一部分，就像洗手、做頭發(fā)和其他類似活動(dòng)一樣。然而，導(dǎo)致體味個(gè)體差異的遺傳和/或環(huán)境因素及其分子機(jī)制是在基因解碼技術(shù)出現(xiàn)后，才得以明確。

腋臭是一種以腋窩有強(qiáng)烈氣味和大量出汗為特征的疾病。腋臭的癥狀通常在青春期出現(xiàn)，此時(shí)從出生時(shí)就存在的頂泌腺首次活躍起來(lái) 。衣服腋窩處的黃色污漬也會(huì)影響患者的生活質(zhì)量。因此，腋臭通常被看作是一個(gè)不受歡迎的問題，尤其是年輕女性。特別是在亞洲國(guó)家，強(qiáng)烈體臭人群占人口的少數(shù)，腋臭往往更令人討厭。特別是在日本，腋臭已被認(rèn)定為一種疾病，其臨床治療由國(guó)民健康保險(xiǎn)制度覆蓋。

腋臭的主要成分是不飽和脂肪酸、羥基化支鏈脂肪酸、硫烷基烷醇和一些類固醇，代表分別為 (E)-3-甲基-2-己烯酸 (3M2H) 、3-羥基-3-甲基己酸 (3H3MH)、3-甲基-3-硫烷基己烷-1-醇 (3M3SH) 、5 α -雄烯酮和 5 α -雄甾-16-烯-3 α -醇（圖 6)。此外，體外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)表明，3M3SH 的假定前體 3M3SH 的谷胱甘肽結(jié)合物可通過 ABCC11 WT 轉(zhuǎn)運(yùn)，提示 ABCC11 參與了腋臭的形成。已發(fā)現(xiàn)這些氣味成分的一些前體是由腋窩頂泌腺分泌的，這表明抑制腋窩頂泌腺的分泌和/或發(fā)育有助于預(yù)防或治療腋臭。

圖 6：人類腋窩氣味化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

腋臭基因檢測(cè)的意義和作用

除腋臭外，ABCC11基因型可能與乳腺癌或藥物引起的毒性風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。根據(jù)《個(gè)人的基因序列與疾病風(fēng)險(xiǎn)》的研究，在日本人群中，攜帶ABCC11 538G等位基因的女性比攜帶 538A 等位基因的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)更高，而在白種人群中并未發(fā)現(xiàn)這種關(guān)聯(lián)。日本的一個(gè)研究小組還表明，乳腺癌女性體內(nèi)的 ABCC11 表達(dá)與侵襲性表型和較差的無(wú)病生存期有關(guān) 。由于一些抗癌藥物及其代謝物是 ABCC11 的底物，因此患者對(duì)核苷類化療的反應(yīng)可能會(huì)受到ABCC11基因型的影響。最近的一項(xiàng)高加索人肝臟隊(duì)列研究表明，ABCC11 SNP 1637C>T（Trp546Met）與 5-氟尿嘧啶（一種廣泛使用的抗嘧啶類抗癌藥物）的毒性風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)聯(lián)。然而，在該歐洲病例研究中，并未發(fā)現(xiàn)ABCC11 538A 等位基因與 5-氟尿嘧啶毒性風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究，最好在 538A 等位基因占主導(dǎo)地位的亞洲進(jìn)行，以闡明這個(gè)問題。此外，ABCC11 如何影響乳腺癌或其起源仍有待澄清。有趣的是，基于它們的生物學(xué)相似性，有人提出乳腺是從頂泌腺進(jìn)化而來(lái)的。由于ABCC11的功能形式可能有助于乳腺以及頂泌腺的發(fā)育和/或活動(dòng)控制，因此需要從各個(gè)方面進(jìn)一步驗(yàn)證，不僅包括化學(xué)抗性，還包括ABCC11的生理功能和調(diào)節(jié)。

腋臭基因檢測(cè)的共識(shí)

在《狐臭基因檢測(cè)、腋臭基因檢測(cè)技術(shù)介紹》章中，狐臭基因檢測(cè)技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)通過一種有效的基因分型方法，探討了人類ABCC11 538G>A 作為腋窩異味風(fēng)險(xiǎn)因素的臨床重要性。這種基于基因分型的策略將有助于腋窩異味的診斷，因?yàn)楂@得的客觀證據(jù)將使 ORS 患者擺脫氣味錯(cuò)覺。狐臭的基因解碼正進(jìn)一步揭示頂泌腺分泌過程的分子機(jī)制，越來(lái)越多的證據(jù)強(qiáng)烈表明 ABCC11 有助于頂泌腺的功能，而ABCC11 538G>A 反映了頂泌腺的活動(dòng)。需要進(jìn)一步研究以闡明 ABCC11 及其從頂泌腺分泌的內(nèi)源性底物的生理功能。因此，驗(yàn)證臨床相關(guān)遺傳因素和開發(fā)用于個(gè)性化醫(yī)療的系統(tǒng)將是下一步的重要步驟。