【佳學基因檢測】為什么腫瘤基因檢測除了全外顯子組外，還需納入miRNA基因檢測？

腫瘤基因檢測導讀：

miRNA基因檢測：

一般來說，microRNAs (miRNAs) 控制著 mRNA 的表達。然而，基因解碼表明，miRNA 也能夠靶向非編碼 RNA，包括長鏈非編碼 RNA 和 miRNA。后者，稱為 miRNA:miRNA 相互作用，是一種自我調(diào)節(jié)形式。在《為什么腫瘤基因檢測除了全外顯子組外，還需納入miRNA基因檢測？》這篇科普介紹中，佳學基因解碼討論了 miRNA 的三種主要模式：miRNA 調(diào)控：直接、間接和全局相互作用，以及它們在癌癥生物學中的意義。佳學基因解碼還討論了 miRNA:miRNA 相互作用的細胞類型特異性、當前的實驗方法和生物大數(shù)據(jù)人工智能分析技術，以及這些策略如何不足以識別新的 miRNA:miRNA 相互作用。miRNA 的自我調(diào)節(jié)及其對基因調(diào)控的影響是佳學基因解碼正在持續(xù)研究的一個新的領域。

miRNA基因檢測關鍵詞: 

RNA 調(diào)控, miRNA 調(diào)控, miRNA:miRNA 相互作用

因為它們對基因表達的影響、在身體組織和體液中的強大存在以及它們作為疾病生物標志物的潛在用途，MicroRNA (miRNA) 在基因解碼的引領下，已經(jīng)成為基礎研究和臨床應用的一個深度技術趨動機構的重點投入領域。這些小的非編碼 RNA 的典型作用是通過 3' 非翻譯區(qū) (UTR) 中的識別位點影響信使 RNA (mRNA)，從而調(diào)節(jié)它們的穩(wěn)定性。miRNA 主要通過靶向 mRNA 影響基因表達水平。miRNA 表達的任何變化都可能影響靶標調(diào)節(jié)的程度，從而影響細胞穩(wěn)態(tài)。因此，miRNA 的相對水平以及由此而產(chǎn)生 mRNA的水平在時空及組織特異性中變化在癌癥的發(fā)生、藥物研究及其他疾病中具有不可忽視的作用。正因為此，佳學基因認為在腫瘤基因檢測中，除了外顯子組基因檢測，還應納入miRNA基因檢測。

基因解碼在miRNA腫瘤基因檢測中作用在于它揭示出miRNA在人體細胞內(nèi)由在細胞核和細胞質(zhì)中的一系列切割階段來產(chǎn)生。初級 (pri)-miRNA 轉(zhuǎn)錄物在細胞核中被微處理器切割，微處理器是由 Drosha 和 Di George 關鍵區(qū)域 8 (DGCR8) 組成的催化復合物 。miRNA基因解碼進一步表明，通過 Drosha 與基礎 UG 基序的相互作用以及 DGCR8 二聚體與頂端 UGU 基序的比對，莖環(huán) pri-miRNA 正確定向指導切割。微處理器切割形成前體 (pre)-miRNA，通過 exportin-5 轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中（Lund 等人，2004 年）。正是在這里，Dicer（也稱為 DICER1）切割 pre-miRNA（Bernstein et al., 2001 )，得到的雙鏈成熟 miRNA 隨后被 Argonaute (AGO) 結合 ( Song et al., 2004 )。引導鏈仍然與 AGO 結合以形成 miRNA 誘導的沉默復合物 (miRISC)，而稱為 miRNA* 搭載鏈（又稱為過客鏈、乘客鏈）被去除和降解 ( Schwarz et al., 2003 )。

miRISC 的主要作用是啟用 RNA 干擾 (RNAi) 途徑，由此 miRNA 的種子區(qū)域，從 5' 端跨越 2-8 個核苷酸 ( Lewis et al., 2003 )，在 mRNA 的 3'UTR識別 Watson-Crick 互補結合位點 ( Lai, 2002 )。盡管成熟 miRNA 在細胞質(zhì)中產(chǎn)生，但研究表明，多達 75% 的已知成熟 miRNA 同時存在于細胞核和細胞質(zhì)中（Gagnon 等人，2014 年）。核 miRNA、它們的核輸入機制和調(diào)控作用雖然已被基因解碼分析，但不是本文要介紹的內(nèi)容。請在佳學基因官網(wǎng)采用適當?shù)年P鍵詞搜索相關內(nèi)容。

盡管 miRNA 的主要作用是進行轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，但它們對其他非編碼RNA的控制成為基因解碼對人體基因信息深入、全面和正確了解的一個重要來源?；蛐畔⒌慕獯a和解密研究已發(fā)現(xiàn) miRNA 與長鏈非編碼 RNA (lncRNA)、環(huán)狀 RNA (circRNA) 和假基因相互作用，以誘導 miRNA 抑制或增加細胞對 miRNA 結合位點的競爭（Gebert 和 MacRae，2019；Ransohoff 等，2018；烏利茨基，2018 年）。在"為什么腫瘤基因檢測除了全外顯子組外，還需納入miRNA基因檢測？"中，佳學基因解碼總結了賊近的研究，這些研究證明了 miRNA 實際上如何調(diào)節(jié)非編碼 RNA，特別關注它們對其他 miRNA 的控制。通過另一種 miRNA 進行 miRNA 調(diào)控的分子過程以前被稱為 miRNA:miRNA 相互作用（Hill 和 Tran，2018）。在"為什么腫瘤基因檢測除了全外顯子組外，還需納入miRNA基因檢測？"中，佳學基因解碼討論了 miRNA:miRNA 相互作用背后的機制、它們在癌癥發(fā)病機制中的作用以及當前研究方法的中需要進一步深入和改進的地方。有關 miRNA 與其他非編碼 RNA 相互作用的更多信息，佳學基因解碼向讀者推薦關于該主題的其他內(nèi)容（Fabbri 等人，2019 年；Grillone 等人，2020 年；Ulitsky，2018 年；Anastasiadou 等人，2018 年）。

miRNA的發(fā)現(xiàn)：miRNA相互作用

果蠅中的互補 miRNA對于 2004 年新穎被注意到，Watson-Crick 結合用于鑒定 miR-5 和 miR-6 之間以及 miR-9 和 miR-79 之間的配對。預計這些 miRNA 對之間的結合比指導 miRNA 和過客 miRNA* 鏈之間的結合更強（Lai 等，2004）。本研究的作者和其他研究小組提出，互補 miRNA 對的形成會增加它們的穩(wěn)定性，或阻止靶點調(diào)節(jié)（Lai 等人，2004 年；Guo 等人，2012 年）。

這些 miRNA 對的鑒定是基于序列分析，并沒有在體外得到證實。然而，這項研究在理論上確立了 miRNA 可以與其他 miRNA 和非編碼 RNA 結合，并提出這可能如何改變穩(wěn)態(tài)基因調(diào)控 ( Lai et al., 2004 )。下面討論的后續(xù)工作已經(jīng)確定了在幾種不同機制下在體外發(fā)生的 miRNA:miRNA 相互作用。miRNA：miRNA 相互作用對細胞功能具有廣泛的影響，并且被認為為 miRNA 和 mRNA 調(diào)節(jié)增加了另一層。

直接 miRNA:miRNA 相互作用

正如該術語所暗示的，當一個 miRNA 以互補方式結合另一個時，就會發(fā)生直接的 miRNA：miRNA 相互作用。這已在細胞質(zhì)中的兩個成熟 miRNA 之間得到證實（Chen 等人，2011；Lai 等人，2004），或涉及細胞核內(nèi)的成熟和 pri-miRNA（Forrest 等人，2010；Tang 等人） ., 2012 ; Wang et al., 2018a ; Zisoulis et al., 2012 ) (圖。1）。

圖。1。

直接 miRNA：miRNA 相互作用。這些發(fā)生在細胞質(zhì)中的兩個成熟 miRNA 之間或細胞核中的成熟和初級 miRNA 發(fā)夾之間。這些核相互作用通常會阻止微處理器的結合，從而阻止初級 miRNA 的成熟，降低其水平并阻止其靶 mRNA 的沉默。兩個成熟 miRNA 之間的細胞質(zhì)相互作用是序列特異性的，并將兩個 miRNA 結合的 RNA 誘導的沉默復合物 (miRISC) 結合在一起。然而，這種相互作用對 miRISC 活動的功能后果尚不有效清楚。

作用機制

一些研究已經(jīng)調(diào)查了 miRNA 之間的直接結合作為 miRNA:miRNA 相互作用的一種模式。其中第一個確定 miR-424 和 miR-503 都通過其 pri-miRNA 形式的識別位點直接調(diào)節(jié) miR-9（Forrest 等，2010）。雖然沒有直接說明，但 pri-miR-9 的靶向意味著這種特殊的相互作用發(fā)生在細胞核內(nèi)。miR-424 和 miR-503 都被歸類為分化 miRNA，這意味著它們促進細胞分化，而 miR-9 是抗分化的。因此，miR-424 和 miR-503 對 miR-9 的下調(diào)抑制了其將細胞維持在未分化狀態(tài)的能力，并促進了細胞譜系的定型和生長（Forrest 等，2010）。

在小鼠中的一項關鍵發(fā)現(xiàn)，即 miR-709 在細胞核中結合 pri-miR-15a/16-1 以調(diào)節(jié)其產(chǎn)生（Tang 等人，2012），引入了 miRNA 層次結構的概念，其中初始組的特定 miRNA 負責 miRNA 的廣泛轉(zhuǎn)錄后控制。這會誘導二級 miRNA 的表達，以繼續(xù)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的級聯(lián)。該研究還表明，miRNA:miRNA 相互作用可以影響生物發(fā)生途徑，從而改變 miRNA 的產(chǎn)生 ( Tang et al., 2012 )。

Zisoulis 等人在一次交流中發(fā)現(xiàn)了 miRNA 的幾個重要方面：miRNA 相互作用。（2012 年）。本研究表明，成熟的秀麗隱桿線蟲miRNA let-7可以結合并調(diào)節(jié)pri-let-7促進其產(chǎn)生，形成正反饋回路（Zisoulis et al., 2012）。由于初級 miRNA 的切割發(fā)生在細胞核中，這一發(fā)現(xiàn)表明成熟的 miRNA 可以遷移到細胞核中發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，從而引發(fā)對核 miRNA 的進一步研究（Zisoulis 等，2012；Liang 等，2013）。此外，這項研究還表明，miRNA 可以通過控制其未成熟形式來調(diào)節(jié)自身的產(chǎn)生。因此，miRNA:miRNA 相互作用可能在自動調(diào)節(jié)中起作用。

兩項關注 miRNA:miRNA 相互作用的研究表明，成熟 miRNA 與 pri-miRNA 的識別和結合會阻礙微處理器的附著并阻止 pri-miRNA 切割，從而降低其豐度。對鼠心肌細胞的分析發(fā)現(xiàn)，pri-miR-484 序列在其轉(zhuǎn)錄本中含有一個 miR-361 的結合位點，這種結合阻止了 pri-miR-484 在細胞核內(nèi)被Drosha切割，從而阻止了心肌細胞凋亡。等人，2014 年）。賊近的一份報告發(fā)現(xiàn)，通常在肝臟中表達的 miR-122 通過控制其初級轉(zhuǎn)錄物的表達來調(diào)節(jié) miR-21 ( Wang et al., 2018a)）。pri-miR-21 轉(zhuǎn)錄本中的 miR-122 識別位點位于 Drosha 識別的區(qū)域內(nèi)，miR-122 與 pri-miR-21 的結合阻斷了 Drosha 介導的切割和加工，賊終減少了成熟 miR-21 的數(shù)量。 21 在細胞內(nèi) ( Wang et al., 2018a )。這種機制對細胞生長和增殖具有重要意義，因為 miR-21 是已知的腫瘤抑制因子程序性細胞死亡 4 (PDCD4) 的調(diào)節(jié)因子（Lu et al., 2008 ; Wang et al., 2018a）。這在肝癌小鼠模型中賊為明顯，其中與野生型 pri-miR-21 相比，添加 miR-122 和突變 pri-miR-21 增加了腫瘤生長。在這種情況下，pri-miR-21 的突變阻止了 miR-122 定向下調(diào)，并增加了總體 miR-21 水平以促進腫瘤發(fā)展（Wang 等人，2018a）。這些 pri-miRNA 序列中 miRNA 結合位點的例子表明，作用于細胞核的 miRNA 可能會干擾 miRNA 的產(chǎn)生，尤其是通過阻斷 Drosha 切割。這可能表明調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào) miRNA 表達的更廣泛的機制。

另一種直接 miRNA:miRNA 相互作用的方式是通過識別兩個成熟 miRNA 內(nèi)的互補序列。例如，miR-107 與抑制腫瘤的 miRNA let-7 內(nèi)的互補序列結合，從而抑制成熟的 let-7。這兩個成熟的miRNA形成的雙鏈在其結構中具有一系列凸起，其中內(nèi)部環(huán)對于相互作用至關重要（Chen et al., 2011）。然而，這種相互作用引發(fā)了關于兩個成熟 miRNA 在被 miRISC 結合時如何進行結合以及 miRISC 成分的作用的問題。一項研究表明，Argonaute 2 (AGO2) 中的氨基酸殘基可以讓 miRNA 與非規(guī)范靶標結合并有助于 miRNA 合作（Flamand et al., 2017）。雖然這尚未在 miRNA:miRNA 相互作用的背景下進行測試，但可能是這種機制負責結合兩個 AGO2 復合物。此外，一些關于 miRNA:miRNA 相互作用的研究提出了它們可能增加 miRISC 穩(wěn)定性的觀點。與目標的規(guī)范結合通常會導致 miRISC 穩(wěn)定，而非規(guī)范結合會導致其不穩(wěn)定（Park et al., 2017）。因此，兩個 miRNA 的直接結合可能有助于穩(wěn)定和防止 miRNA 降解。

這些例子顯示了 miRNA:miRNA 相互作用的可變性，并提出了與 pri-miRNA 和成熟 miRNA 之間這種調(diào)節(jié)模式的程度有關的問題。此外，核 miRNA 執(zhí)行轉(zhuǎn)錄后沉默的正確機制，包括其他 miRNA 的機制（Tang 等人，2012 年；Wang 等人，2018a，2014 年；Zisoulis 等人，2012 年）)，仍有待充分理解。由于多項研究描述了成熟 miRNA 與 pri-miRNA 鏈的結合，這種結合機制可能代表了一種尚未有效探索的更廣泛的 miRNA 調(diào)節(jié)模式。兩個成熟 miRNA 結合背后的機制以及它如何調(diào)節(jié)兩個 miRNA 的 RISC 成分也尚未得到解釋。

對疾病的影響

幾種直接的 miRNA:miRNA 相互作用與疾病發(fā)展有關。成熟的 let-7 miRNA 受 miR-107 控制。因為 let-7 是一種腫瘤抑制因子，它的下調(diào)和 miR-107 的抑制導致其靶癌基因的豐度增加，有助于下游腫瘤發(fā)生 ( Chen et al., 2011 )。同樣，由于 miR-484 在心肌細胞凋亡中的作用 ( Wang et al., 2012 )，miR-361 和 miR-484 之間的直接相互作用對心肌梗塞等心臟病具有影響 ( Wang et al., 2014 ) . 此外，miR-503 和 miR-484 對 pri-miR-9 的下調(diào)促進了細胞譜系的確定（Forrest 等人，2010）。如果這種相互作用被破壞，miR-9就會上調(diào)，導致癌細胞典型的未分化狀態(tài)。

另一種致癌 miRNA，miR-21，在大多數(shù)實體惡性腫瘤中過度表達。在非癌性肝細胞中，miR-21 處于 miR-122 介導的抑制作用下，這會增加 miR-21 靶基因PDCD4的表達，從而控制細胞增殖。然而，如果 miR-122 調(diào)節(jié)缺失，miR-21 表達增加，導致 PDCD4 水平下降，從而導致癌癥表型（Lu 等人，2008 年；Wang 等人，2018a）。miR-21 上調(diào)影響細胞增殖和大小，并允許癌細胞繼續(xù)生長和存活。因此，miR-122 和 pri-miR-21 之間的 miRNA:miRNA 相互作用對于控制細胞穩(wěn)態(tài)、細胞周期和預防致癌變化至關重要。

由于討論的許多 miRNA:miRNA 相互作用涉及將成熟 miRNA 運輸?shù)郊毎艘哉{(diào)節(jié) pri-miRNA，因此確定 miRNA 運輸是否在癌細胞中發(fā)生改變非常重要。中斷 miRNA 的核輸入將阻止 pri-miRNA 靶向，并可能改變其靶 miRNA 和 mRNA 的表達，從而增加致癌改變的級聯(lián)。這方面的一個例子已經(jīng)被證明，其中 importin 8 的敲低阻止了 miR-709 轉(zhuǎn)運到細胞核中，隨后增加了 miR-15a/16-1 的水平 ( Wei et al., 2014）。建議進一步研究確定 miRNA 在癌細胞中與正常生理水平相比的核和細胞質(zhì)分布，以評估是否對 miRNA 和 mRNA 表達有影響。

間接 miRNA:miRNA 相互作用

盡管討論的幾項研究表明 miRNA 能夠在其生物發(fā)生的不同階段直接調(diào)節(jié) miRNA，但 miRNA:miRNA 相互作用也可以通過間接方式發(fā)生。圖 2）。

圖 2。

間接 miRNA：miRNA 相互作用。這些相互作用是通過 miRNA 定向抑制 miRNA 生物發(fā)生途徑成分或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子而發(fā)生的。生物發(fā)生成分的抑制對特定 miRNA 的產(chǎn)生產(chǎn)生影響，而不是對整體 miRNA 產(chǎn)生的預期負面影響。靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑可能包括轉(zhuǎn)錄因子、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和阻遏物。

轉(zhuǎn)錄因子的作用

一種這樣的 miRNA:miRNA 相互作用途徑是轉(zhuǎn)錄控制及其對 miRNA 產(chǎn)生的影響。在該模型中，miRNA 靶向編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（如轉(zhuǎn)錄和甲基化因子）的 mRNA 的 3'UTR，以誘導其表達發(fā)生變化。通過這種方式，一個 miRNA 可以通過作為基因調(diào)控網(wǎng)絡的一部分控制其轉(zhuǎn)錄或調(diào)控途徑來調(diào)節(jié)另一個 miRNA 的表達（Song et al., 2015）。因此，這種 miRNA:miRNA 相互作用是由二級轉(zhuǎn)錄控制引起的，而不是直接相互作用。

這種調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的第一個例子在小鼠成年心肌細胞中得到證實，其中 miR-208a 調(diào)節(jié)了 miR-208b 和 miR-499 的轉(zhuǎn)錄 ( van Rooij et al., 2009）。在這里，miRNA 編碼在各種肌球蛋白基因的內(nèi)含子中。在快速肌球蛋白基因中編碼的 miR-208a 能夠負調(diào)節(jié)負責沉默含有 miR-499 和 miR-208b 的慢速肌球蛋白基因轉(zhuǎn)錄物表達的阻遏物。miR-208a 的增加會降低慢肌球蛋白基因抑制因子的可用性，從而降低 miR-499 和 miR-208b 的上調(diào)。在心臟中，miR-208b 上調(diào)需要額外存在壓力信號，例如鈣或甲狀腺功能減退，但 miR-499 的激活不需要外部刺激。這些 miRNA 的增加通過靶向阻遏物誘導慢肌基因的表達。慢肌基因的激活放大了包含 miR-499 和 miR-208b 的基因表達的信號。van Rooij 等人，2009 年）。這是第一個通過 miRNA 介導的轉(zhuǎn)錄因子和阻遏物控制引入 miRNA 調(diào)節(jié)概念的研究（van Rooij 等人，2009 年；Zhang 和 Zeng，2010 年）。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一個涉及 miR-20a 和 E2 因子 (E2F) 家族的轉(zhuǎn)錄因子的自動調(diào)節(jié)環(huán)，它們是重要的細胞周期和細胞凋亡調(diào)節(jié)劑。在這種反饋機制中，含有 miR-20a 的 miR-17-92 家族調(diào)節(jié) E2F 基因的表達 ( Sylvestre et al., 2007 )。同時，E2F 成員 E2F1、E2F2 和 E2F3 通過與其啟動子結合激活 miR-20a 的表達。通過這種方式，miR-20a 水平的增加抑制了 E2F 轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生，隨后降低了 miR-20a 轉(zhuǎn)錄。作者提出，這種機制的主要作用是調(diào)節(jié) E2F 基因的表達以防止細胞凋亡 ( Sylvestre et al., 2007）。然而，這個反饋回路也突出了轉(zhuǎn)錄因子介導的間接 miRNA 自動調(diào)節(jié)。

賊近對肺癌細胞的一項研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子 miR-660-5p 通過小鼠雙分鐘 2 (MDM2) 和 p53 (也稱為 TP53) 控制 miR-486-5p 的表達 ( Borzi et al., 2017 ) . 在該模型中，miR-660 沉默其直接靶標MDM2，從而導致 p53 增加（Borzi 等人，2017 年）。因為 p53 是一種參與 miRNA 生物發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子，并且是一種有效的腫瘤抑制因子，它在 MDM2 沉默時的激活會啟動 miR-486-5p、miR-29 和 miR-34 家族的轉(zhuǎn)錄（Borzi 等人，2017） . 因此，該網(wǎng)絡通過它們對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的控制證明了 miRNA:miRNA 調(diào)節(jié)的更廣泛影響。

除了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子外，miRNA 還可能通過誘導表觀遺傳標記的變化來影響其他 miRNA 的產(chǎn)生。一項對舌鱗狀細胞癌組織的研究表明，miR-29b 下調(diào) DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶基因DMNT3B，進而改變 miR-195 啟動子的甲基化模式。這誘導了 miR-195 產(chǎn)生的增加，產(chǎn)生了一個正調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其中 miR-29b 的上調(diào)增加了 miR-195 的水平。由于這兩種 miRNA 都是在癌癥中下調(diào)的腫瘤抑制因子，這種機制可能為舌鱗狀細胞癌提供治療窗口（Jia et al., 2016）。這些例子展示了通過轉(zhuǎn)錄因子、啟動子和表觀遺傳學間接控制 miRNA 如何對 miRNA 表達產(chǎn)生更廣泛的影響，以及影響包括癌癥發(fā)展在內(nèi)的多種細胞途徑的能力（Ali Syeda 等人，2020 年）。

miRNA生物發(fā)生成分的作用

miRNA 可以調(diào)節(jié) miRNA 生物發(fā)生途徑成分的表達，這些成分已被證明會影響幾種 miRNA 的產(chǎn)生，并且可能會影響細胞系統(tǒng)中 miRNA 的整體豐度。一項針對上皮性卵巢癌的研究表明，miR-98-5p 可以通過靶向 Dicer 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄物來調(diào)節(jié) miR-152 的表達，形成間接的 miRNA:miRNA 相互作用（Wang et al., 2018b）。該研究表明，miR-152 水平會隨著 miR-98 過表達和 Dicer 敲低而發(fā)生變化。然而，由于 Dicer 參與該途徑，預計該系統(tǒng)中大多數(shù) miRNA 的表達水平會發(fā)生變化（Song 和 Rossi，2017 年），并且這種調(diào)節(jié)方式將不限于 miR-152 .

另一項研究還調(diào)查了涉及生物發(fā)生途徑成員 AGO2 的間接 miRNA：miRNA 相互作用（Leonov 等人，2015 年）。在人真皮淋巴管內(nèi)皮細胞中，當被肉豆蔻酸佛波醇 (PMA) 激活時，miR-132 會抑制 AGO2。相反，抑制 miR-132 會導致 AGO2 增加。miR-132 的 PMA 激活還導致 miR-221 減少和 miR-146a 增加，隨后抑制 miR-132 使 miR-221 和 miR-146a 升高。這些 miRNA 表現(xiàn)出隨著 AGO2 的降低而降低成熟與前 miRNA 的比率，這意味著它們的成熟鏈不太豐富（Leonov 等人，2015）。然而，該研究還強調(diào)，其他調(diào)節(jié)機制也可能有助于觀察到 miR-221 和 miR-146a 的變化（Leonov 等人，2015 年）。這些 miRNA 之間的相互作用對炎癥和血管生成有影響，因為促血管生成 miR-132 促進了抗血管生成 miR-221 的減少和炎癥 miR-146a 的增加（Leonov 等，2015）。

這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)，盡管 miRNA 本身對 miRNA 生物發(fā)生途徑成分的下調(diào)可能導致 miRNA 豐度的整體下降，但研究人員更普遍地觀察到這種機制僅影響選定的 miRNA。對于生物發(fā)生途徑的幾個成員，例如 Drosha，miRNA 靶位點尚未經(jīng)過實驗驗證（Chou 等人，2018 年；Kishore 等人，2011 年）。有人建議，如果 Drosha 受到 miRNA 的負調(diào)控，由于其在 miRNA 產(chǎn)生中的關鍵作用，這將對 miRNA 組產(chǎn)生影響。在文獻中也很明顯，對 miRNA 的改變及其產(chǎn)生對細胞相互作用和功能的總體影響缺乏了解。

對癌癥的影響

幾種 miRNA：miRNA 相互作用被整合到對癌癥進展至關重要的途徑中。這種相互作用包括 miR-205 和 miR-184 之間的相互作用，其介導含有脂質(zhì)磷酸酶 SH2 的磷酸肌醇 5'-磷酸 2 (SHIP2；也稱為 INPPL1) 的水平 ( Yu et al., 2008 )。這兩種 miRNA 在SHIP2的 3'UTR 內(nèi)具有重疊的結合位點，由此 miR-184 通過阻止進入結合位點而不誘導調(diào)節(jié)來介導 miR-205 驅(qū)動的 SHIP2 抑制。然而，在癌癥中觀察到 miR-205 的增加和 miR-184 的減少，這也降低了 SHIP2，特別是在角膜鱗狀細胞癌中（Yu et al., 2008）。由于 SHIP2 參與 AKT 通路，這對細胞增殖、生長和凋亡有影響，這意味著這種 miRNA:miRNA 相互作用是癌癥表型的主要貢獻者。

先前描述的涉及 miR-660-5p、MDM2 和 miR-486-5p 的 miRNA：miRNA 相互作用被提議通過穩(wěn)定腫瘤抑制因子 p53 作為肺癌治療的潛在靶標（Borzi 等，2017）。除其他功能外，p53 還參與 PI3K-AKT 通路，并且通常在癌癥中失調(diào)。因此，該途徑的破壞會導致 p53 不穩(wěn)定，從而對癌癥發(fā)展產(chǎn)生下游影響。博爾齊等人。(2017)提出誘導 miR-660-5p 可能是一種潛在的治療方法，因為它對 MDM2 的抑制將有效地穩(wěn)定 p53，減少腫瘤生長。

同樣，miR-98 和 miR-152 通過上文討論的 Dicer 調(diào)節(jié)的間接相互作用（Wang 等人，2018b）對上皮性卵巢癌的化療耐藥性有影響。在這種癌癥類型中，觀察到高水平的 miR-98 和低水平的 miR-152，這導致 DNA 修復基因RAD51的上調(diào)，促進了化療耐藥性 ( Wang et al., 2018b )。小鼠體內(nèi)模型顯示，與僅用 miR-152 或順鉑治療的腫瘤相比，用 miR-152 和化療劑順鉑治療的腫瘤明顯更小，細胞增殖減少（Wang et al., 2018b）。該研究表明，miRNA:miRNA 相互作用也有助于癌細胞的形態(tài)學和抗治療特性。

已發(fā)現(xiàn)致癌 miRNA miR-21 參與多種 miRNA:miRNA 相互作用；例如，通過間接調(diào)節(jié)結腸癌中 miR-145 的表達來維持致瘤性變化（Yu et al., 2015）。miR-21 的增加啟動 K-Ras 信號傳導，激活轉(zhuǎn)錄因子 Ras 反應元件結合蛋白 (RREBP；也稱為 RREB1)，進而抑制 miR-145 的轉(zhuǎn)錄 ( Yu et al., 2015 )。因此，在癌癥中觀察到的 miR-21 的增加導致 miR-145 的表達降低，從而放大了致癌變化。此外，miR-21 水平受 miR-122 靶向其初級鏈的影響，以防止肝細胞的致癌變化（Wang 等人，2018a）。

全球 miRNA:miRNA 相互作用

我們已經(jīng)討論了一個 miRNA 可以調(diào)節(jié)其他幾個或整個 miRNA 家族的表達的想法（Borzi 等人，2017）。然而，很少有研究關注 miRNA 對細胞系統(tǒng)中全局 miRNA 表達的影響。圖 3）。

圖 3。

全局 miRNA：miRNA 相互作用是由于細胞內(nèi)控制 miRNA 表達的反應達到頂點。這些考慮了 miRNA 和 mRNA 表達的所有直接和間接變化，以響應 miRNA 表達的擾動。全面理解 miRNA 的復雜性：細胞系統(tǒng)中的 miRNA 相互作用涉及多種機制的整合，以及對 miRNA 和 mRNA 的繼發(fā)性變化的考慮。

在Matkovich 等人的開創(chuàng)性研究中，高階 miRNA：miRNA 相互作用在小鼠心臟細胞中得到解決。(2013) , 其中下游 miRNA 和 mRNA 變化是針對 miR-499 和 miR-378 進行測量的。miR-499 的轉(zhuǎn)基因過表達上調(diào)了 11 個 miRNA，下調(diào)了 6 個 miRNA，而 miR-378 上調(diào)了 18 個 miRNA，下調(diào)了 31 個 miRNA。結果表明 miR-499 和 miR-378 都影響其他心臟 miRNAs 的轉(zhuǎn)錄，盡管不是直接的，因為目標 miRNAs 的穩(wěn)定性和引導-乘客鏈比沒有受到影響 ( Matkovich et al., 2013)）。在受影響的 miRNAs 中，有 13 個在 miR-499 或 miR-378 直接靶向的基因內(nèi)編碼，因此在轉(zhuǎn)基因模型中被共同調(diào)控，這解釋了一小部分受調(diào)控的 miRNAs 背后的機制。提示 miRNA 的其余變化是 miR-499 和 miR-378 靶標失調(diào)的結果。值得注意的是，miR-378 抑制 MAF 和 RORA 轉(zhuǎn)錄因子，導致 miR-99 減少。因此，31 個 miR-99 靶標被 miR-378 間接解除調(diào)控（Matkovich et al., 2013）。作者還發(fā)現(xiàn)，在 miR-499 模型中，76 個下調(diào)的 mRNA（7.8%）是 miR-499 的靶標，298 個（31%）是上調(diào)的 miRNA 的靶標。有人提出剩余的 595 個（75%）下調(diào)的 mRNA 是繼發(fā)性 miRNA 變化的結果。這是該領域的一項重要研究，因為它確定了 miRNA 水平的變化對 miRNA 環(huán)境具有全球影響，導致繼發(fā)性 mRNA 和 miRNA 變化。因此，這項研究拓寬了我們對驅(qū)動間接 miRNA:miRNA 相互作用的機制的理解。

正如我們上面所討論的，已經(jīng)研究了 miRNA 通過它們對 miRNA 表達的影響來間接調(diào)節(jié)靶轉(zhuǎn)錄物。沙哈布等人。(2012)在卵巢癌細胞中過表達 miR-7，并分析了 miRNA 和 mRNA 表達水平的變化。他們確定了細胞環(huán)境中的二級調(diào)控基因 ( Shahab et al., 2012）。然而，問題仍然在于 miRNA 的引入如何以間接和直接的方式影響下游 miRNA 水平。關于單個 miRNA 變化對 miRNA 組的更廣泛影響已經(jīng)出現(xiàn)了幾種理論，包括 miRNA 基因組編碼區(qū)下游啟動子活性的變化、失調(diào)基因中包含 miRNA 序列或轉(zhuǎn)錄因子活性改變的影響（Shahab等人，2012 年）。

賊近的研究觀察到，一種 miRNA 可以調(diào)節(jié)另一種 miRNA 的表達，以放大對共同靶點的調(diào)節(jié)作用。肺動脈高壓中 miR-130/301 家族表達水平升高，導致 miR-204、miR-322 和 miR-503 通過過氧化物酶體增殖物激活受體 γ (PPARG) 和信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子 3 降低。 STAT3) ( Bertero et al., 2014）。在缺氧條件下，miR-130/301 家族的升高導致 PPARG 有針對性地降低。在肺動脈平滑肌細胞內(nèi)，這會導致 STAT3 升高，從而導致 miR-204 表達降低，從而導致細胞增殖增加。此外，在肺動脈內(nèi)皮細胞中，PPARG 抑制 apelin 以及 miR-424 和 miR-503，也增加了細胞增殖。這兩種途徑共同促進內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖，導致肺動脈高壓表型。在 miRNA 中觀察到的變化及其對細胞增殖的影響表明，許多 miRNA 可能協(xié)同作用以驅(qū)動分子變化，從而產(chǎn)生比單個 miRNA 的作用更大的影響（Bertero 等人，2014）。

miRNA 協(xié)同作用的概念意味著存在“主調(diào)節(jié)劑”miRNA，一種影響細胞系統(tǒng)內(nèi)大多數(shù) miRNA 的 miRNA。因此，主調(diào)節(jié) miRNA 表達的任何變化也會改變其協(xié)同網(wǎng)絡中的 miRNA。同樣，靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的 miRNA 可能會改變功能相似的 miRNA 的轉(zhuǎn)錄活性，以幫助協(xié)調(diào)反應 ( Ooi et al., 2017 )。

然而，很少有研究調(diào)查這種 miRNA:miRNA 相互作用現(xiàn)象，尤其是在癌細胞中。鑒于其對 miRNA 和 mRNA 環(huán)境的巨大整體影響，主調(diào)節(jié)因子和協(xié)同 miRNA 的變化可能對細胞產(chǎn)生可怕的后果，并可能影響癌癥中改變的許多細胞途徑。因此，重要的是在癌細胞系統(tǒng)中研究全局 miRNA:miRNA 相互作用。

miRNA：疾病中的miRNA相互作用

上述章節(jié)中討論的許多例子已經(jīng)在癌癥的背景下進行了觀察和測試。然而，關于 miRNA:miRNA 相互作用的性質(zhì)、它們失調(diào)背后的機制以及對它們在化療耐藥背景下影響的理解，仍然存在幾個問題。

細胞類型的排他性

鑒于 miRNA 和 mRNA 表達與細胞類型相關，可以假設 miRNA:miRNA 調(diào)節(jié)網(wǎng)絡也傳達了這種特異性。核 miRNA 分布也由細胞類型決定，因此延伸到核 miRNA:miRNA 相互作用的范圍（Salmanidis 等人，2014 年）。當前的預測算法沒有考慮到這種區(qū)別（Rock et al., 2019）。因此，來自 miRNA:target 相互作用數(shù)據(jù)庫的信息可能無法傳達所研究的細胞類型，這可能導致在挖掘數(shù)據(jù)時得出不正確的結論。這些不正確性也會影響用于繪制 miRNA:miRNA 網(wǎng)絡的基因和 miRNA。來自一種細胞類型的網(wǎng)絡不能用于推斷另一種細胞類型。目前，目標信息的細胞特異性和miRNA預測是一個正在進行的研究領域，挖掘現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的研究人員應該將細胞特異性作為關鍵因素考慮。

失調(diào)背后的機制

目前，對于癌癥中 miRNA 的失調(diào)，還沒有一種理論或機制?？紤]到生理系統(tǒng)的復雜性，可能有多種機制在起作用，包括那些涉及 miRNA 生物發(fā)生成分、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和 miRNA 鏈內(nèi)突變的機制。

miRNA 生物發(fā)生途徑成分的異常會影響 miRNA 的表達。賊近的一份報告顯示，Dicer 的 RNase IIIb 結構域內(nèi)的突變耗盡了 5p 鏈 miRNA，這影響了 3p 與 5p 成熟 miRNA 的比率（Vedanayagam 等人，2019 年）。3p 與 5p 比率的改變改變了靶向基因的譜，例如在子宮內(nèi)膜癌中，具有 Dicer 突變的患者的基因被解除抑制，這些基因包含富含 let-7、miR-17、miR-15/16、 miR-29 和 miR-101 家族。盡管罕見，但在其他幾種癌癥（包括膀胱癌、腎癌和子宮癌）中也觀察到 Dicer 突變，并且可能僅在特定組織中提供選擇性優(yōu)勢（Vedanayagam 等，2019）。這項研究提出了 miRNA:miRNA 網(wǎng)絡如何響應鏈選擇的變化而改變的問題，因為這會影響靶基因和下游轉(zhuǎn)錄因子和 miRNA 的表達。

同樣重要的是要考慮抑制 miRNA 轉(zhuǎn)運進入細胞核是否會影響 miRNA 靶向 pri-miRNA 或基因啟動子的程度。在 exportin-5 功能喪失突變的情況下，pre-miRNA 無法運輸?shù)郊毎|(zhì)中，導致成熟 miRNA 水平下降（Kim et al., 2016）。因此，假設成熟 miRNA 的減少可能會影響兩個細胞區(qū)室中的 miRNA:miRNA 相互作用，從而導致癌癥表型 ( Hata and Kashima, 2016 )。

在全基因組范圍內(nèi)，超級增強子的丟失或獲得對 miRNA 和基因表達有廣泛的影響，超級增強子是包含多個增強子元件并共同結合多個轉(zhuǎn)錄因子的基因組位點（Suzuki et al., 2017）。在正常生理條件下，超級增強子控制決定細胞類型的基因和 miRNA 的轉(zhuǎn)錄。如果改變，這會導致細胞特異性喪失，這是典型的致癌作用（Matsuyama 和 Suzuki，2019 年）。決定細胞類型的 miRNA 的減少導致先前以較低水平表達的 miRNA 的增加。因此，這種改變的 miRNAome 控制了一組不同的基因，進一步增加了潛在的致癌變化 ( Li et al., 2018）。通常，超增強子區(qū)域的缺失會導致腫瘤抑制 miRNAs 的增加，而超增強子的增加會豐富致癌 miRNAs ( Suzuki et al., 2017 )。因此，未來對 miRNA:miRNA 相互作用的研究必須在系統(tǒng)范圍內(nèi)進行，以更好地了解 miRNA 表達及其靶標可能發(fā)生的變化（Matsuyama 和 Suzuki，2019 年）。

另一個驅(qū)動 miRNA 表達變化的因素是其種子區(qū)域內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性 (SNP) ( Lewis et al., 2003 )。種子序列對于與目標 mRNA 或目標識別序列的結合是必不可少的。對這些域中的任何一個進行更改都可能導致失去目標調(diào)節(jié)。此外，不同的 miRNA 異構體 (IsomiRs) 可以通過添加來自 miRNA 的 5' 或 3' 末端的核苷酸來改變種子區(qū)域。IsomiR 對基因靶向有影響，并在疾病發(fā)展中發(fā)揮作用（Bofill-De Ros 等人，2020 年）。改變種子區(qū)域的 SNP 或 IsomiR 的存在有可能改變 mRNA 和 miRNA 的表達，這將對細胞環(huán)境產(chǎn)生級聯(lián)效應（Króliczewski 等，2018）。miRNA 種子序列參與 miRNA:miRNA 相互作用的程度目前尚不清楚。然而，有人認為該區(qū)域的改變可能會破壞 miRNA-mRNA-miRNA 網(wǎng)絡。

協(xié)助開發(fā)療法

了解 miRNA 之間的相互作用及其對基因表達的影響對于探索潛在的癌癥療法及其脫靶效應是不可或缺的（Lapa 等人，2019 年）。一些關于 miRNA:miRNA 相互作用的報告研究了這些網(wǎng)絡在它們對化學治療劑的反應的背景下，例如對 Erb-B2 受體酪氨酸激酶 2 (ERBB2) 抑制劑曲妥珠單抗在乳腺癌中的反應 ( Cilek et al., 2017 )，卵巢癌中的順鉑耐藥 ( Wang et al., 2018b ) 或?qū)嶒炐钥?miRNA 藥物，如 miR-34 ( Ooi et al., 2017）。進一步研究 miRNA:miRNA 在癌癥和其他疾病中的相互作用將有利于我們對這些疾病的機制理解，并有助于確定可行的治療靶點。

生物信息學的作用

生物信息學方法在研究 miRNA:miRNA 相互作用的影響方面發(fā)揮了重要作用。一些研究將與基因、miRNA 和 lncRNA 相互作用相關的數(shù)據(jù)庫結合在一個網(wǎng)絡中（Liu 和 Ye，2019；Ulitsky，2018；Zhao 等人，2008）。這使人們對可能導致疾病的編碼和非編碼遺傳因素有了更深入的了解。

例如，當給定的 miRNA 改變 mRNA 的表達時，這可能反過來改變下游 miRNA 的表達。miRNA-mRNA-miRNA 網(wǎng)絡的形成可用于識別控制網(wǎng)絡內(nèi)大多數(shù) miRNA 表達的主調(diào)節(jié) miRNA（Hu et al., 2020 ; Ooi et al., 2017），例如 miR- 1 已使用生物信息學鑒定為前列腺癌中潛在的主要調(diào)節(jié) miRNA（Alshalalfa，2012 年）。顯然，生物信息學是理解不同 RNA 種類之間相互作用以及識別主調(diào)節(jié) miRNA 和 miRNA 層次結構的重要技術方法（Bertero 等，2014）。

miRNA 之間的相互作用也已通過識別具有重疊子通路的那些來確定（Wu et al., 2013）。在這里，作者使用計算工具表明 miR-21 與下調(diào)的 miRNA 的聯(lián)系比與上調(diào)的 miRNA 的聯(lián)系更多。同樣，這可能會影響分析中 miR-21 和其他 miRNA 參與的直接途徑，但也會通過這些 miRNA 間接影響其他亞途徑（Wu et al., 2013）。

然而，需要持續(xù)考慮的一個問題是缺乏與 miRNA 和 mRNA 表達和相互作用的細胞特異性有關的信息。這包括存在于細胞核和細胞質(zhì)中并具有活性的 miRNA，以及細胞特異性 IsomiR ( Salmanidis et al., 2014 )。當前預測 miRNA 結合的算法，例如 miRanda ( Betel et al., 2010 )，沒有考慮組織或細胞的起源類型，這可能會扭曲生物信息學和實驗分析 ( Rock et al., 2019 )。miRNA 序列的細胞特異性變異也為 miRNA 靶標和 miRNA:miRNA 相互作用的鑒定增加了額外的復雜性（Glogovitis 等人，2021）。此外，僅基于生物信息學分析的發(fā)現(xiàn)應通過體外實驗得到證實（Liu 和 Ye，2019 年）。

許多研究 miRNA 對控制細胞過程的更廣泛影響的研究使用 miRNA 測序 (miRNAseq) 或 miRNA 陣列方法。目前的陣列方法只能識別具有高置信度的注釋 miRNA，而 miRNAseq 已被用于識別新的 miRNA 和 IsomiR，尤其是細胞類型特異性的那些。因此，與 RNAseq 配對，miRNAseq 是確定 miRNA 變化及其各自靶標水平的先進方法，隨后可用于網(wǎng)絡分析。

如前所述，一些直接的 miRNA:miRNA 相互作用涉及成熟 miRNA 識別 pri-miRNA 鏈內(nèi)的結合區(qū)域（Tang 等人，2012；Wang 等人，2018a；Zisoulis 等人，2012）。雖然 miRNA 的前體序列是已知的并且注釋很好，但每個 miRNA 的一級序列的序列相對未知。許多研究試圖定義 pri-miRNA 序列庫，但由于 pri-miRNA 的高度瞬態(tài)性，這已被證明是困難的，有幾項研究使用了 Drosha 依賴的測序協(xié)議 ( Kim et al., 2017 )。目前，多達 20% 的已知 miRNA 尚未顯示具有 pri-miRNA 基序或有效鑒定的 pri-miRNA 序列 ( Auyeung et al., 2013）。研究人員還通過設計前體鏈上游和下游 100 bp 的引物來靶向 pri-miRNA 鏈（Conrad 等人，2020），以定義 pri-miRNA 序列本身（Wang 等人，2018a）。然而，這種方法限制了識別調(diào)控元件的潛力，包括 miRNA 結合位點，這些位點可能位于所選引物指定的區(qū)域之外。

miRNAseq 和 RNAseq 文庫的生物信息學分析對于發(fā)現(xiàn) miRNA:miRNA 相互作用及其細胞影響非常寶貴。然而，研究人員應該仔細考慮當前方法的局限性和缺點，并通過生命系統(tǒng)的實驗來驗證發(fā)現(xiàn)。

本綜述中討論的 miRNA:miRNA 相互作用的范圍擴展到特定癌癥環(huán)境的背景。盡管許多癌癥類型表現(xiàn)出相似的特征，但 miRNA 的表達、miRNA:miRNA 調(diào)節(jié)途徑和靶點抑制程度是特定于起源細胞類型的（Matsuyama 和 Suzuki，2019 年；Shao 等人，2019 年）。因此，在調(diào)查 miRNA:miRNA 相互作用和廣泛應用這些發(fā)現(xiàn)時必須謹慎，因為由 miRNA 與 miRNA 關聯(lián)介導的特定調(diào)節(jié)途徑在其他細胞類型中可能不同。

目前研究 miRNA:miRNA 相互作用的策略通常涉及轉(zhuǎn)染 miRNA 模擬物或反義抑制劑。任何基于這些方法的結論都需要謹慎，因為引入外源性 miRNA 會固有地改變內(nèi)源性 miRNA 和 mRNA 表達（Khan et al., 2009）。應與加擾 miRNA 對照進行比較，以識別生物學相關的變化。另一種方法可能是在初級或前體轉(zhuǎn)錄階段調(diào)節(jié) miRNA，以避免 AGO2 飽和。另一種可能性是使用適體或更長的反義鏈來隔離內(nèi)源性 miRNA。未來的實驗應該考慮如何確定 miRNA:miRNA 相互作用及其對細胞功能的影響，而不會有效改變內(nèi)源性 miRNA 和 mRNA 的微妙平衡。

目前，很少有 miRNA 研究考慮 miRNA 對整體 miRNA 表達的更廣泛影響。miRNA 領域：miRNA 相互作用通常集中在一對特定的 miRNA 或一小部分，而不是 miRNA 環(huán)境中發(fā)生的變化。由 miRNA:miRNA 相互作用導致的 miRNA 和 mRNA 改變已被證明會影響細胞生長和轉(zhuǎn)移（Borzi 等人，2017；Wang 等人，2018a）。通過考慮一個或幾個 miRNA:miRNA 相互作用，我們忽略了 miRNA 介導的調(diào)節(jié)固有的系統(tǒng)級影響。

總之，miRNA:miRNA 相互作用，尤其是那些包含 miRNA 和 mRNA 環(huán)境的相互作用，需要重新評估，而這種增加的調(diào)節(jié)途徑可能支持或推動對疾病機制的更好理解。有趣的是，細胞核中 miRNA 的存在及其靶向 pri-miRNA 的潛力表明它們在基因調(diào)控中的作用可能比靶向 mRNA 的 3'UTR 的經(jīng)典模型更廣泛。我們不能再持有一個簡單的 miRNA 可以調(diào)節(jié)多個靶點的概念。相反，這必須擴展以納入 miRNA 可以相互調(diào)節(jié)的想法。由于 miRNA 是有效的調(diào)節(jié)劑，并且已被證明可以驅(qū)動致癌途徑，因此 miRNA:miRNA 相互作用的影響可能是深遠的。向前進，

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